Pikornavirusten tyypitys kliinisistä näytteistä RT-qPCR -menetelmällä

Abstract

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää ja testata vuokaaviota, jonka avulla voidaan kliinisistä näytteistä tunnistaa ja tyypittää entero-, rino- tai parechoviruksia. Vuokaaviossa käytetään kvantitatiivista käänteiskopiointi-polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) -menetelmää. Erilaisia alukkeita ja ajo-ohjelmia käyttämällä virus tunnistetaan ja PCR-tuote sekvensoimalla ja analysoimalla saadaan selville kunkin pikornavirusnäytteen tyyppi. Työssä vertailtiin ensin virus-RNA:n eristysmenetelmiä käyttäen ns. ENRI-menetelmää ja tunnettuja enterovirusnäytteitä. Eristyskittejä vertailtiin RT-qPCR-laitteen antamaan Ct-arvoon perustuen ja sopivinta eristysmenetelmää käytettiin työssä. Työn aikana analysoitiin 71 kpl THL:n FinOM Cohort study -tutkimuksessa kerättyä näytettä, joiden oletettiin sisältävän virusta. Vuokaaviossa edettiin seuraavasti: Virus-RNA:t (vRNA) eristettiin ja ne analysoitiin ENRI-testillä. ENRI-testissä positiivisiksi osoittautuneet näytteet analysoitiin VP4/2-testillä rinovirusten tyypittämiseksi (ns. rinotyypitys) ja enterovirusten tunnistamiseksi. VP4/2-alueen sekvensointitulosten perusteella enteroviruksista tehtiin vielä VP1-testi (ns. enterotyypitys) sekvensoimalla VP1-alueesta tuotettu PCR-pala. ENRI-negatiiviset näytteet tutkittiin parechovirusten osalta ns. PAR-ENRI-testissä. PAR-ENRI:ssä positiivisen tuloksen tuottaneet näytteet tyypitettiin. Parechotyypitystestissä oikeankokoiset PCR-tuotteet lähetettiin sekvensoitavaksi. Sekvenssejä verrattiin geenipankin sekvensseihin ja lähin samankaltainen sekvenssi osoitti näytteen tyypin. Työn aikana saatiin tyypitettyä kaikki entero-, rino- ja parechovirus-positiiviset näytteet, joita oli yhteensä 28 kpl. Näytteistä kaksi tyypitettiin rinoviruksiksi, kuusi parechoviruksiksi ja loput 20 näytettä enteroviruksiksi.

The purpose of this thesis was to develop and test a workflow which would allow the typing of viruses from a fairly large number of samples. The workflow should enable virus typing from clinical samples if the viruses are either entero-, rhino- or parechoviruses. Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) is the primary method used in the workflow. The use of different primers and run protocols allows the production of different PCR products that can be sequenced and analyzed. First different methods for extraction of virus-RNA (vRNA) were compared using so called ENRI protocol and known enterovirus samples. The performance of each extraction method was determined based on the Ct value obtained by RT-qPCR. The most appropriate method was used to prove the effectivity of the workflow. In this study 71 samples from the FinOM Cohort study by National Institute for Health and Welfare (Finland) were analyzed using the workflow. In the workflow the samples were subjected to an ENRI test after vRNA extraction. If a sample was positive in the ENRI test, a VP4/2-test was conducted in order to type rhinoviruses (so called rhinotyping) and to identify enteroviruses. If the VP4/2 sequencing result indicates enterovirus, a VP1-test (so called enterotyping) was performed. If a sample was negative in ENRI test, a parecho-ENRI (PAR-ENRI) test was conducted. If a sample was positive in the PAR-ENRI test, parechotyping was performed in order to type the parechovirus. The obtained sequences were compared to GenBank sequences in order to obtain the type name for the virus sample. The closest match in the GenBank indicates the virus type. Out of 71 clinical samples 28 were typed as a picornavirus. Two rhinoviruses, six parechoviruses and 20 enteroviruses were identified, respectively.