ÄKTA oligopilot plus DNA-syntetisaattorin kvalifiointi

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli tehdä käyttöönottokvalifiointi uudelle ÄKTA oligopilot plus DNA-syntetisaattorille. Kvalifiointi, joka perustui Wallac Oy:n laadunhallintajärjestelmään, sisälsi synteesilaitteiston asennuksen kvalifioinnin (IQ) ja toiminnan kvalifioinnin (OQ).

Toimeksiantajalla oli ennestään käytössä tuotannossa Applied Biosystems 3400 DNA-syntetisaattori, joka haluttiin vaihtaa uudempaan toimintavarmuuden takaamiseksi. Syntetisoituja DNA-oligonukleotideja käytetään koettimina vastasyntyneiden seulontatuotteessa, jolla seulotaan SCID-oireyhtymää (Severe Combined Immunodeficiency Disorder).

Osana toiminnan kvalifiointia testattiin DNA-synteesimenetelmiä. Testien avulla selvitettiin millaisilla parametreilla synteesimenetelmistä saataisiin mahdollisimman tehokkaita. Samalla testattiin toimeksiantajan aiemmin käyttämän kantajamateriaalin soveltuvuus uudelle synteesilaitteistolle. Synteesilaitteistolle suunnitellulla kantajalla testattiin sille sopivat synteesiparametrit. Synteesimenetelmien testauksen yhteydessä haluttiin myös osoittaa, että toimeksiantajan oman modifioidun fosforamidiitin on oltava kuivattua ennen oligonukleotidisynteesiä. Synteesin jälkeisessä käsittelyssä testattiin kahta eri menetelmää irrottaa oligonukleotidi kantajasta ja poistaa oligonukleotidissa olevat suojaryhmät.

Synteesimenetelmien testauksesta saatujen tulosten perusteella voitiin todeta molempien kantajamateriaalien toimivan uudella synteesilaitteistolla, mutta synteesimenetelmät eroavat toisistaan. Sekä toimeksiantajan oma että yleisesti käytössä oleva synteesin jälkeinen käsittelymenetelmä osoittautuivat toimiviksi molemmilla kantajamateriaaleilla. Lopullinen oligonukleotidin sekvenssin oikeellisuus ja puhtaus määritettiin analyyttisella UPLC-MS ajolla. Tuloksena saatiin yksi selkeä tuotepiikki, jossa ei näkynyt sivutuotteita. Sekvenssin oikeellisuus selvitettiin antamalla käytetty sekvenssi Mongo Oligo –ohjelmaan, ja saatua ionisaatiosarjaa verrattiin oman oligonukleotidispektrin ionisaatiosarjaan.

The aim of this study was to qualify a new ÄKTA oligopilot plus DNA synthesizer. Based on the quality management system of Wallac Oy, the qualification included the installation qualification (IQ) and the operational qualification (OQ) of the synthesis equipment.

The commissioner was already using an Applied Biosystems 3400 DNA synthesizer in production and wanted to replace it with a new instrument in order to improve performance reliability. Synthesized DNA oligonucleotides are used as probes in a neonatal screening product for the screening of SCID syndrome (Severe Combined Immunodeficiency Disorder).

As part of the operational qualification, DNA synthesis methods were tested in order to determine the parameters for the most efficient synthesis methods. At the same time, the suitability of the previously used solid support material for the new synthesizer was tested as were the synthesis parameters for the new support designed for the Äkta Oligopilot Plus synthesizer. Along with the synthesis method testing it was shown, that commissioner’s own modified phosphoramidite has to be dried before the oligonucleotide synthesis. Two different methods for post-synthetic processing were tested to cleave the oligonucleotide from the solid support and for deprotection.

In summary, according to the results from the synthesis method testing, both solid supports were proven to work in the new synthesizer, but the synthesis methods differ from each other. Both the commissioner’s own and the commonly used post-synthetic processing method were proven to work on both solid supports. The final accuracy and purity of the oligonucleotide sequence were determined with a UPLC-MS run. As a result, one clear product peak was obtained and no by-products were shown. The ionization series for the synthesized sequence was determined using the Mongo Oligo-program and it was compared with the received MS spectra of the oligonucleotide.