2A-proteaasien kloonaus, tuotto ja karakterisointi

Abstract

Enterovirus-suvun edustajat tunnetaan laajalti patogeeneinä, jotka aiheuttavat ihmisille muun muassa polion, enterorokon, yleisen flunssan ja sydänläppätulehduksen kaltaisia tauteja. Viruksen lisääntymisen ja siten infektioiden leviämisen kannalta olennaisessa roolissa ovat viruksen omat post-translationaaliset polypeptidin pilkkoutumiseen osallistuvat 2A- ja 3C-proteaasit. Tutkimalla kyseisten proteaasien aktiivisuuksia ja etsimällä niiden aktiivisuutta inhiboivia yhdisteitä, voidaan mahdollisesti kehittää antiviraalisia yhdisteitä, joilla estetään virusten aiheuttamia vakavia tauteja.

Työn tavoitteena oli tuottaa 2A-proteaaseja E.coli-bakteerisoluissa ja tutkia niiden ominaisuuksia sekä mahdollista aktiivisuutta. Työn kohteena oli yhdeksän eri enteroviruslajin 2A-proteaasia. Työn tarkoituksena oli kloonata histagilliset 2A-proteaasien geenit osaksi plasmidi-vektoria ja transformoida ne haluttua proteiinia yli-ilmentäviin E.coli-bakteerisoluihin. Tuotto-olosuhteiden optimoinnin jälkeen 2A-proteaasit puhdistettiin affiniteettikromatografialla, jonka jälkeen niiden ominaisuuksia tutkittiin erilaisin biokemiallisin menetelmin. Työ suoritettiin Tampereen Yliopiston proteiinidynamiikan tutkimusryhmään vakiintuneilla ja hyväksi todetuilla biokemiallisilla menetelmillä.

Työn tulokset olivat mielenkiintoiset ja paikoin odottamattomat. Suurin osa kohdeproteiineista tuottuivat. Kuitenkin johtuen joidenkin proteiinien pienestä konsentraatiosta, niiden havaitseminen ei ollut selkeää vasta-ainevärjäyksissä. Samasta syystä myös aktiivisuuskokeiden ja vasta-ainevärjäysten tulokset olivat paikoin ristiriidassa. Useassa tapauksessa proteiinia menetettiin dialyysissä aggregoitumisen vuoksi. Kaikilla aktiivisuuskokeissa mukana olleilla 2A-proteaaseilla mitattiin kyky pilkkoa kohdepeptidiä. Työn ohella, ilman varsinaista tarkoitusta, todettiin nikkelin ja EDTA:n vaikuttavan merkittävästi 2A-proteaasien aktiivisuuksiin.

Työ tehtiin osana suurempaa virustutkimusta ja työn tuotteita sekä tuloksia tullaan käyttämään tulevaisuudessa tieteellisen julkaisun kirjoittamiseen ja jatkotutkimuksien tekemiseen. Proteaasien tutkimus jatkuu eri 2A-proteaasien kineettisten ominaisuuksien määrittämisen sekä niiden aktiivisuutta inhiboivien pienmolekyylien etsimisen parissa.

Representatives of enterovirus family are known as big virus pathogens, which cause a variety of diseases in humans, for example polio, hand, food and mouth disease, common cold and inflammation of the cardiac valve. 2A- and 3C proteases have a significant role in the onset of virus infection and reproduction. These proteases cleave virus’s own post-translational polyprotein which allows formation of many vital functional protein for the virus. By studying these proteases, their activity and finding possible inhibitors for them, it is possible to develop antiviral medicine that prevents serious virus infection.

The aim of this thesis was to produce 2A proteases in E.coli bacterial cell and study their properties and possible activities. Nine different enterovirus species were studied. The main objective was to clone his-tagged 2A protease genes into plasmid vector and transform them into protein production E.coli cells in which the target protein would be over-expressed. After optimizing protein production conditions the 2A proteases were purified by affinity chromatography. After purification, it was possible to study the target proteins’ properties via various biological techniques. Methods established and proven by the protein dynamics research group at Tampere University were followed in the process.

The results of this study were interesting and surprising. Most of the target protein were successfully produced. Sometimes reading a positive result from antibody staining was not easy because the concentration of target protein was low. For the same reason, the activity tests’ results and western blot results were at odds with each other in some situations. There were also challenges with dialysis due to target protein aggregation. The ability to cleave target polypeptide was measured from those constructs which were subjected to an activity test. As a side product of the analyses conducted, it was detected that nickel and EDTA influence the activities of 2A proteases.

This thesis was made as a part of a more extensive virus research and in future its products and results will be used in scientific publication and further research. Protease research will continue by measuring kinetic feature of various 2A proteases and searching small molecular inhibitors for them.