Menetelmien kehitys ihmisen VAP-1 kalvoproteiinin ligandin etsimiseksi
Pohjansalo, Maritta (2010)
Turun ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201004136418
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201004136418
Tiivistelmä
Opinnäytetyössä on kehitetty ihmisen kalvoproteiini VAP-1:n (vaskulaarinen adheesiomolekyyli-1) karakterisoinnin työmenetelmiä, jotka ovat osa tutkimusta sen toistaiseksi vähän tunnetun ligandin (vastinmolekyyli) etsimiseen. Adheesiomolekyylit välittävät lymfosyyttien kulkeutumista vastinmolekyylien avulla ja tapahtuma on tärkeä osa immuunipuolustusta.
Kun DNA:n nukleotidiin tehdään mutaatio, pystytään tuottamaan muokattua proteiinia ja käyttämään sitä molekyylin ominaisuuksien tutkimiseen. Tarkoituksena oli tuottaa kolmenlaisia VAP-1D386N- mutanttiproteiineja stabiilien tuottolinjojen avulla ja tutkia niitä proteiinitasolla. Karakterisoinnilla varmistettiin, että transfektantit toimivat
halutulla tavalla ja että suuritöiset tuottolinjat kannatti valmistaa.
Työssä tehtiin kohdistettu mutageneesi kolmeen DNA-konstruktiin,jotka transfektoitiin nisäkässoluihin. Transientteja solulinjoja ylläpidettiin ja niistä tehtiin immunovärjäystestauksia, jotka analysoitiin virtaussytometrillä. Niiden solulysaateista tehtiin aktiivisuuskokeita. Kun stabiilit tuottosolulinjat oli tehty, mutantti- ja villityypin proteiinia puhdistettiin immunoaffiniteettikromatografialla.Proteiinit analysoitiin myös SDS-PAGE:lla.
Kun DNA:n nukleotidiin tehdään mutaatio, pystytään tuottamaan muokattua proteiinia ja käyttämään sitä molekyylin ominaisuuksien tutkimiseen. Tarkoituksena oli tuottaa kolmenlaisia VAP-1D386N- mutanttiproteiineja stabiilien tuottolinjojen avulla ja tutkia niitä proteiinitasolla. Karakterisoinnilla varmistettiin, että transfektantit toimivat
halutulla tavalla ja että suuritöiset tuottolinjat kannatti valmistaa.
Työssä tehtiin kohdistettu mutageneesi kolmeen DNA-konstruktiin,jotka transfektoitiin nisäkässoluihin. Transientteja solulinjoja ylläpidettiin ja niistä tehtiin immunovärjäystestauksia, jotka analysoitiin virtaussytometrillä. Niiden solulysaateista tehtiin aktiivisuuskokeita. Kun stabiilit tuottosolulinjat oli tehty, mutantti- ja villityypin proteiinia puhdistettiin immunoaffiniteettikromatografialla.Proteiinit analysoitiin myös SDS-PAGE:lla.