Mikrokystiini-LR:n määritys ELISA-menetelmällä : Menetelmän validointi Kokemäenjoen vesistön vesiensuojeluyhdistys ry:lle

Abstract

Sinilevien eli syanobakteerien seurannalla on Suomessa vakiintunut asema, ja sinilevien tuottamien toksiinien esiintyminen erityisesti järvivesissä on ajankohtainen aihe kesäisin. Nykyinen seurantajärjestelmä perustuu sinilevähavaintojen keräämiseen viranomais- ja kansalaisvoimin ja niistä tiedottamiseen, mutta varsinaista käytäntöä fykotoksiinien määritykseen järvivesistä ei ole vielä syntynyt. Immunologisiin menetelmiin kuuluva ELISA perustuu antigeenin - tässä tapauksessa mikrokystiinin - ja vasta-aineen reaktioon, jossa antigeeni kilpailee sidoksesta vasta-aineeseen entsyymillä leimatun antigeenin kanssa. Tuloksena on värillinen lopputuote, jonka absorbanssi on kääntäen verrallinen näytteen mikrokystiinikonsentraatioon.

Opinnäytetyön aihe on immunologisen ELISA-menetelmän validointi KVVY:lle, jolla tähdätään fykotoksiini mikrokystiini-LR:n kvantitatiiviseen määrittämiseen raakavesinäytteistä. Menetelmä on tyypiltään pikakitti, joka sisältää tarvittavat reagenssit, mutta vaatii tulosten kvantitatoimiseksi fotometrisen mittauslaitteen. Tavoitteena oli saada menetelmä validoitua kesäkauden 2017 alkuun.

Validointia varten laadittiin validointisuunnitelma KVVY:n omien laatustandardien ja VTT:n validointiohjeiden pohjalta yhdenmukaistamalla ja tarkastamalla validointia varten valittavat parametrit. Menetelmän validointimenettelyn yhteydessä otettiin käyttöön spektrofotometri tulosten kvantitatoimiseksi ja tarkasteltiin analyysin suoritukseen liittyviä tekijöitä määrityksen optimoimiseksi. Validointimittaukset suoritettiin hyväksytyn validointisuunnitelman mukaan ja tulokset käsiteltiin tilastollisesti, minkä jälkeen tehtiin johtopäätökset menetelmän käyttöönotosta ja lisäkäsittelyn tarpeesta.

Validoinnin tuloksista oli pääteltävissä, että menetelmä ei toteudu täysin valmistajan antamissa raja-arvoissa. Useampi validoinnin parametri ei saavuttanut sille asetettua tavoitearvoa, ja analyysiketjun loppuvaiheessa tarvittava spektrofotometri asetti haasteita analyysin suoritukseen lisäämällä epävarmuustekijöitä ylimääräisen työvaiheen muodossa sekä värillisen lopputuotteen siirtämisessä kyvetteihin määrätyn aikarajan sisällä.

Menetelmänä ELISA soveltuu hyvin mikrokystiinin kaltaiselle antigeenille, mutta työn tulosten perusteella suositellaan lisämittausten lisäksi joko valmistajan omaan fotometriin siirtymistä tai vaihtoehtoisesti uudempiaikaisen, samalla periaatteella toimivan kuoppalevymenetelmän käyttöönottoa.

Cyanobacteria, also known as the blue green algae, have long been monitored in Finnish water bodies as a potential health hazard especially during the summer season. In spite of monitoring programme aimed at informing the general public of the extent of blooms, there’s no regulation for quantitation of phycotoxins such as microcystins in the lake water. The ELISA method is based on immunologic reactions between antibodies and antigens – in this context, microcystin – the antigen competes for the binding location of the antibody with an enzyme-linked antigen. The end product is a colorful solution that has absorbance which is invertedly proportional to the microcystin concentration in the solution.

Topic of this thesis is a validation of immunologic ELISA method aimed at quantitative determination of microcystin-LR where the sample matrix is lake water. The method is ready to use since it is a kit which contains all necessary reagents, but requires an external photometric device to detect the signal given by the samples. The topic was provided by KVVY, who wished the method could be validated and ready for use in the summer of 2017.

A validation plan was formulated based on KVVY’s own quality standards and VTT’s validation guidebook by streamlining relevant parameters to be tested. During the validation process, a spectrophotometer was deployed for the purpose of quantitation of the results and variables related to the analysis process were observed and optimized where suitable. Validation measurements were carried out according to the approved plan and results were statistically processed, after which conclusions on validation of the method and further processing were made.

From the results it was deduced that the method does not fully comply with the specifications given by the manufacturer. More than few of the parameters’ goal values were not met, and usage of the spectrophotometer added an extra step and uncertainty in the analysis chain as the end product had to be transferred from tubes to the cuvettes within a given timeline.

The ELISA method is well suitable for an antigen such as microcystin, but based on the results further validation steps are recommended along with possibly switching to manufacturer’s own photometer. Alternatively newer 96-well assay plate method could be considered.