RNA:n, DNA:n ja proteiinien koon, pitoisuuden ja laadun määrityksen validointi Bioanalyzer 2100 -laitteelle

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin FICAM:lle, joka on Tampereen yliopiston lääketieteen ja biotieteiden tiedekuntaan kuuluva tutkimuskeskus. FICAM on eläinkokeille vaihtoehtoisten menetelmien asiantuntijakeskus, joka kehittää ja validoi in vitro kudos- ja elinmalleja. Kudos- ja elinmallit perustuvat erilaistettuihin kantasoluihin, joista rakennetaan useiden solutyyppien yhdistelmä soluviljelyssä. Malleista voidaan eristää mm. RNA:ta, josta tutkitaan esimerkiksi geeniekspressiota ja arvioidaan sytotoksisuutta. FICAM:iin oli hankittu bioanalysaattori RNA:n, DNA:n ja proteiinien koon ja määrän analysointiin, mutta laite ei ollut vielä GLP-käytössä.

Opinnäytetyön tavoitteena oli todistaa bioanalysaattori hyväksyttäväksi GLP-käyttöön. Tarkoituksena oli validoida laite ja menetelmät RNA:n, DNA:n ja proteiinien pitoisuuden, koon ja laadun määritykseen. Menetelmiin valittiin sopivat kitit ja referenssiaineet laitteen käyttötarkoituksen perusteella. Tulosten perusteella arvioitiin järjestelmän toiminnan ja kittien toistettavuutta ja tarkkuutta. FICAM:in vaatimusten sekä Bioanalyzer 2100 -laitteen valmistajan, Agilent Technologies:in ilmoittamien arvojen perusteella validoinnille asetettiin hyväksymiskriteerit.

Bioanalyzer 2100 läpäisi validoinnin hyväksymiskriteerit RNA:n DNA:n ja proteiinien koon, pitoisuuden ja eheyden määrityksessä. Laite sopii rutiinimenetelmiin sekä laadunvarmistukseen. Analyyseihin tarvitaan hyvin vähän reagensseja, mikä on kustannustehokasta sekä vaarallisen jätteen määrä vähenee. Jatkotoimenpiteenä laitteelle voidaan tarvittaessa validoida useampi kitti sen mukaan, millaisia näytteitä halutaan analysoida.

This thesis was commissioned by FICAM, which is a GLP certified research facility in faculty of medicine and life sciences, University of Tampere. FICAM is specialized in developing and validating in vitro tissue and organ models to replace animal testing. From these models RNA, DNA and proteins can be isolated and analyzed to study gene and protein expression. Bioanalyzer 2100 (Agilent) was purchased for analyzing the RNA, DNA and protein samples and the system had to be validated before it could be used in GLP studies.

The aim of this thesis was to prove that the Bioanalyzer 2100 system fulfills the GLP requirements. The purpose was to validate this Bioanalyzer 2100 system and assays for the determination of RNA, DNA and protein concentration, size and quality. Suitable reference samples and analysis kits were selected based on the use of the system in FI-CAM. The samples were tested based on the instructions provided by Agilent Technologies. Results were analyzed for the repeatability, reproducibility and accuracy of the system and kits. The computerized system was tested for its authentication security and integrity of the data generated. Acceptance criteria for the validation were set based on the requirements of FICAM and values provided by the Agilent Technologies.

Bioanalyzer 2100 passed the validation in determining RNA and protein size and con-centration, and DNA size. The system is suitable for routine assays and quality control. The results are quantitative and the assays require very small amounts of reagents which is cost effective and reduces the production of hazardous waste. As a follow-up several different kits could be validated for the system depending on the sample types.