PCR-menetelmän optimointi nifH-typensitojageenin monistamiseksi turvenäytteistä

Abstract

Polymeraasiketjureaktio eli PCR (Polymerase Chain Reaction) perustuu yksinkertaiseen tekniikkaan, jolla DNA:ta saadaan monistettua nopeasti tuhansiksi kopioiksi. PCR-menetelmä on optimoitava kullekin templaatti-aluke-parille erikseen. Optimoinnissa on otettava huomioon reagenssimäärät ja lämpötilaohjelma. PCR-menetelmän eräs sovellus, nested-PCR, on tehokas tapa monistettaessa pientä DNA-määrää. Menetelmä koostuu kahdesta peräkkäisestä PCR-reaktiosta, joissa käytetään eri alukepareja. Kehittämis-tehtävän tarkoituksena oli optimoida PCR-menetelmä nifH-typensitojageenin monistamiseksi turvenäytteistä. Lisäksi työhön sisältyi DNA:n eristys turvenäytteistä.

Menetelmän optimoinnissa alukkeina käytettiin yksivaiheisessa PCR-reaktiossa PolF- ja PolR-alukkeita sekä nested-PCR-menetelmässä FGPH19–PolR- ja PolF-GC–AQER-alukepareja. Työssä optimoitiin reagenssimäärät ja lämpötilaohjelma. Näytteinä mene-telmän optimoinnissa käytettiin kahden typensitojabakteerin DNA:ta ja kahta pintatur-venäytesarjaa, joista toisesta eristettiin DNA kaupallisen kitin avulla. Toisen sarjan DNA oli eristetty jo aikaisemmin.

Käytettäessä nested-PCR-menetelmää saatiin monistettua haluttua geeniä. Nested-PCR-menetelmän suuresta herkkyydestä johtuen reaktiossa monistui myös kaksi muuta tuo-tetta. Nostettaessa jälkimmäisen PCR-reaktion annealing-lämpötilaa saatiin ylimääräisten tuotteiden monistuminen heikkenemään. PolF–PolR-alukeparilla ei saatu monistettua haluttua geeniä, vaan alukkeet muodostivat joko alukedimeerejä tai sekundäärira-kenteita. Optimoinnin tuloksena nifH-geenin monistuksessa päädyttiin käyttämään nes-ted-PCR-menetelmää, jossa alukkeina käytetään FGPH19–PolR- ja PolF-GC–AQER-alukepareja. PCR-reaktioissa käytetään eri annealing-lämpötiloja.

Näytteille voidaan tehdä jatkotoimenpiteinä denaturoivan gradientin geelielektroforeesi (DGGE) ja sekvensointi, jolloin saadaan selville, onko PCR-reaktiossa monistunut tuote nifH-geeni. Lisäksi PCR-reaktiossa monistunut tuote voidaan puhdistaa ennen sekven-sointia kaupallisella kitillä, jossa halutut vyöhykkeet leikataan agaroosigeelistä ja puh-distetaan.