Hyppää sisältöön
    • Suomeksi
    • På svenska
    • In English
  • Suomi
  • Svenska
  • English
  • Kirjaudu
Hakuohjeet
JavaScript is disabled for your browser. Some features of this site may not work without it.
Näytä viite 
  •   Ammattikorkeakoulut
  • Tampereen ammattikorkeakoulu
  • Opinnäytetyöt (Avoin kokoelma)
  • Näytä viite
  •   Ammattikorkeakoulut
  • Tampereen ammattikorkeakoulu
  • Opinnäytetyöt (Avoin kokoelma)
  • Näytä viite

PCR-menetelmän optimointi nifH-typensitojageenin monistamiseksi turvenäytteistä

Kangas, Hanna (2010)

 
Avaa tiedosto
Kangas_Hanna.pdf (371.0Kt)
Lataukset: 


Kangas, Hanna
Tampereen ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Näytä kaikki kuvailutiedot
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201005098470
Tiivistelmä
Polymeraasiketjureaktio eli PCR (Polymerase Chain Reaction) perustuu yksinkertaiseen tekniikkaan, jolla DNA:ta saadaan monistettua nopeasti tuhansiksi kopioiksi. PCR-menetelmä on optimoitava kullekin templaatti-aluke-parille erikseen. Optimoinnissa on otettava huomioon reagenssimäärät ja lämpötilaohjelma. PCR-menetelmän eräs sovellus, nested-PCR, on tehokas tapa monistettaessa pientä DNA-määrää. Menetelmä koostuu kahdesta peräkkäisestä PCR-reaktiosta, joissa käytetään eri alukepareja. Kehittämis-tehtävän tarkoituksena oli optimoida PCR-menetelmä nifH-typensitojageenin monistamiseksi turvenäytteistä. Lisäksi työhön sisältyi DNA:n eristys turvenäytteistä.

Menetelmän optimoinnissa alukkeina käytettiin yksivaiheisessa PCR-reaktiossa PolF- ja PolR-alukkeita sekä nested-PCR-menetelmässä FGPH19–PolR- ja PolF-GC–AQER-alukepareja. Työssä optimoitiin reagenssimäärät ja lämpötilaohjelma. Näytteinä mene-telmän optimoinnissa käytettiin kahden typensitojabakteerin DNA:ta ja kahta pintatur-venäytesarjaa, joista toisesta eristettiin DNA kaupallisen kitin avulla. Toisen sarjan DNA oli eristetty jo aikaisemmin.

Käytettäessä nested-PCR-menetelmää saatiin monistettua haluttua geeniä. Nested-PCR-menetelmän suuresta herkkyydestä johtuen reaktiossa monistui myös kaksi muuta tuo-tetta. Nostettaessa jälkimmäisen PCR-reaktion annealing-lämpötilaa saatiin ylimääräisten tuotteiden monistuminen heikkenemään. PolF–PolR-alukeparilla ei saatu monistettua haluttua geeniä, vaan alukkeet muodostivat joko alukedimeerejä tai sekundäärira-kenteita. Optimoinnin tuloksena nifH-geenin monistuksessa päädyttiin käyttämään nes-ted-PCR-menetelmää, jossa alukkeina käytetään FGPH19–PolR- ja PolF-GC–AQER-alukepareja. PCR-reaktioissa käytetään eri annealing-lämpötiloja.

Näytteille voidaan tehdä jatkotoimenpiteinä denaturoivan gradientin geelielektroforeesi (DGGE) ja sekvensointi, jolloin saadaan selville, onko PCR-reaktiossa monistunut tuote nifH-geeni. Lisäksi PCR-reaktiossa monistunut tuote voidaan puhdistaa ennen sekven-sointia kaupallisella kitillä, jossa halutut vyöhykkeet leikataan agaroosigeelistä ja puh-distetaan.
Kokoelmat
  • Opinnäytetyöt (Avoin kokoelma)
Ammattikorkeakoulujen opinnäytetyöt ja julkaisut
Yhteydenotto | Tietoa käyttöoikeuksista | Tietosuojailmoitus | Saavutettavuusseloste
 

Selaa kokoelmaa

NimekkeetTekijätJulkaisuajatKoulutusalatAsiasanatUusimmatKokoelmat

Henkilökunnalle

Ammattikorkeakoulujen opinnäytetyöt ja julkaisut
Yhteydenotto | Tietoa käyttöoikeuksista | Tietosuojailmoitus | Saavutettavuusseloste