Pikornavirusgenomin monistus RT-PCR-menetelmällä

Abstract

Työn tarkoituksena oli kehittää ja optimoida menetelmä jolla on mahdollista monistaa kokonainen pikornavirusgenomi hyödyntäen pitkää RT-PCR-menetelmää. Tässä menetelmässä virus-RNA käännetään ensin RT-entsyymin avulla cDNA:ksi, josta PCR-reaktiossa muodostetaan genomin pituinen DNA-juoste. Näytteinä käytettiin plasmidiin kloonattuja virusgenomeja ja virus-RNA:ta.

Työssä oli tarkoitus kokeilla kaupallisesti saatavilla olevien eri valmistajien RT- ja PCR-entsyymejä pitkä-RT-PCR-menetelmässä. Työ oli suunniteltu tehtäväksi siten, että ensin testattiin PCR-entsyymejä ja sitten RT-entsyymejä kehitetyn RT-PCR-menetelmän kanssa. Alustavan analyysin perusteella valittiin parhaat PCR-entsyymit uusiin kokeisiin, joissa testattiin miten syklimäärä ja nukleotidikonsentraatio vaikuttivat reaktioiden toimivuuteen.

Työn aikana todettiin kahden PCR-entsyymin toimivan muita paremmin tutkimukseen valittujen näytteiden kanssa. Kehitetty PCR-menetelmä osoitti toimivuutensa ja sitä voidaan jatkossa käyttää RT-entsyymien testauksessa RT-PCR-reaktiossa, jota ei ehditty viemään loppuun projektin aikana.

The purpose of this study was to develop and optimize a method for complete picornavirus genome amplification by long range RT-PCR. In this method the viral RNA and a RT enzyme are used to synthetize cDNA that forms a whole genome length DNA strand during PCR reaction. Viral genomes cloned into plasmid and viral RNA were used as templates in the reaction.

Several commercially available RT and PCR enzymes from different manufacturers were intended to be tested for their ability to amplify long genomic fragments. The study plan was to first test the PCR enzymes and then the RT enzymes using the developed RT-PCR protocol. Based on preliminary analysis the best performing PCR enzymes were chosen for further tests in which the effect of PCR cycles and nucleotide concentration on the reaction result were tested.

Two of the PCR enzymes possessed superior performance over the rest of the enzymes. A functional long PCR protocol was developed, and it can be utilized in future studies, e.g. to test RT enzymes in RT-PCR reaction, which was not optimized due to time limitations.