Analyysimenetelmien kehittäminen injektoitavalle hydrogeelille biofarmaseuttisen malliaineen annosteluun

Abstract

Biofarmaseuttiset lääkevalmisteet ovat bioteknologian avulla tuotettuja biologisia lääkeaineita, joiden käyttö lääkevalmisteina on yleistynyt. Synteettiset ja bioyhteensopivat biomateriaalit ovat merkittävässä ja kasvavassa asemassa biofarmaseuttisten proteiinien ja muiden lääkeaineiden kontrolloidussa annostelussa. Yleisesti käytetystä silikahydrogeelistä voidaan kehittää annostelijoita, jotka vapauttavat lääkeaineen tasaisesti halutulla nopeudella ennalta määritetyn ajanjakson ajan. Kontrolloidulla lääkeannostelulla voidaan vaikuttaa hoidon turvallisuuteen ja luotettavuuteen samalla vähentäen lääkehävikkiä sekä sivuvaikutuksia.

Opinnäytetyössä tutkittiin biofarmaseuttisille lääkeaineille mallina toimivan proteiinin (GFP, Green fluorescent protein) kontrolloitua vapautumista injektoitavasta silikahydrogeelistä dissoluutiotesteissä. Tarkoituksena oli kehittää luotettava kvantitatiivinen eli määrällinen analyysimenetelmä silikahydrogeelistä vapautuneen GFP:n mittaukseen. Työssä vertailtiin kolmea eri menetelmää (Bradford, Micro BCA ja fluorometria), sekä kehitettiin toimivaa ja luotettavaa käänteisfaasinestekromatografimenetelmää (RP-HPLC) GFP:n määritykseen. Lisäksi pohdittiin HPLC:n käyttöönoton mahdollisuutta dissoluutionäytteiden kvantitatiiviseen ja kvalitatiiviseen eli laadulliseen analysointiin.

Tulosten perusteella GFP:n kvantitatiivisia analyysimenetelmiä pitää kehittää edelleen. Silikahydrogeelin liukoisuustuotteen todettiin häiritsevän mittaussignaaleja kaikilla käytetyillä menetelmillä, mutta häiriön riippuvuutta konsentraatioista pitää vielä tutkia. Silikan liukenemistulokset osoittivat, että valmistettujen hydrogeelien rakenteellisessa homogeenisuudessa oli merkittäviä eroja.

Kehitetty HPLC-menetelmä vapautuneen GFP:n määrittämiseen vaatii vielä lisää tutkimustyötä, jotta se soveltuisi dissoluutiotestin kvantitatiiviseksi ja kvalitatiiviseksi analyysimenetelmäksi. Opinnäytetyön tulokset osoittivat, ettei dissoluutiotestinäytteiden proteiinikonsentraatio ole riittävä käytetyllä HPLC-menetelmällä analysoitavaksi.

Biopharmaceuticals, usually proteins, are medical drugs produced by using biotechnology. These drugs have gradually gained medical acceptance and popularity in the pharmaceutical industry. The use of synthetic and the biocompatible biomaterials has increased significantly as carrier materials in drug-controlled release for biopharmaceutical proteins and other drugs. For example, silica hydrogel combined with the drug can be used as a drug delivery system by delivering the drug controlledly in a predictable and characterizable manner. Controlled drug delivery has a positive impact on the safety and reliability of medical treatment while also reducing drug waste and side effects.

This thesis studied the release of encapsulated Green Fluorescent Protein from injectable silica hydrogel in dissolution tests. GFP was used as a model molecule for the biopharmaceutical drug. The purpose of the thesis was to develop a reliable quantitative method for released GFP determination. Three different quantitative methods (Bradford, Micro BCA, and fluorometry) were compared. In addition, a reliable and functional reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for GFP was developed. Also, the potential of HPLC in the quantitative and qualitative analysis of dissolution samples was studied in this thesis.

Based on the results, the quantitative analysis methods for released GFP determination need to be developed further. The solubility product of silica-hydrogel was detected to interfere with the measured signals in each tested method, but further studies are required to understand the relationship between the interference and the concentrations. The results for the dissolved silica proved that there were significant differences between the structural homogeneities of the hydrogels used.

The HPLC method for the release of GFP developed in this thesis requires more research so as to be suitable for use as the quantitative and qualitative analytical method of the dissolution test. The results indicated that the protein concentration of the dissolution samples was not sufficient to be analyzed by the developed HPLC method.