Reaaliaikaisen PCR-menetelmän kehittäminen : työohje laktoosi-intoleranssiin vaikuttavan pistemutaation genotyypitykseen

Abstract

Ajan saatossa ihmiselle kehittynyt laktoosinsietokyky on seurausta yhden emäksen kohdalla tapahtuneesta geenimutaatiosta. Maailmanlaajuisesti tarkasteltaessa laktoosi-intoleranssin esiintyvyydessä on suuria alueellisia eroja. Laktoosin sietokykyyn vaikuttavan geenimutaation esiintyvyys on yleisempää alueilla, joilla lehmänmaito on ollut merkittävä ravinnonlähde. Afrikassa ja Aasiassa on kansoja, joiden keskuudessa jopa 90 %:lla on edelleen laktoosi-intoleranssi, kun taas esimerkiksi Suomessa vastaava luku on vain n. 18 %.

DNA-tutkimukset ovat nykyisin perusterveydenhuollon rutiinitutkimuksia ja niitä hyödynnetään esimerkiksi laktoosi-intoleranssia tutkittaessa. Reaaliaikaiseen polymeraasiketjureaktioon perustuvat menetelmät ovat tällä hetkellä keskeinen käytössä oleva DNAtutkimuksen muoto kliinisessä laboratorioanalytiikassa. Tämän opinnäytetyön tavoitteena on monipuolistaa bioanalytiikan koulutusohjelman molekyylibiologian opetusmenetelmiä Tampereen ammattikorkeakoulussa ja mahdollistaa RT-PCR-menetelmien hyödyntäminen bioanalyytikoiden koulutuksessa Applied Biosystems StepOnePlusTM Realtime PCR Systems -analysaattorilla. Opinnäytetyön tarkoituksena on uuden menetelmän pystyttäminen sekä työohjeen tuottaminen laktoosi-intoleranssiin vaikuttavan pistemutaation tutkimiseksi bioanalyytikko-opiskelijoiden molekyylibiologian kurssin käyttöön. Opinnäytetyön osana tuotetaan myös käyttöohje Applied Biosystems StepOnePlusTM Real-time PCR-analysaattorille.

Opinnäytetyön kirjallisen osion tehtävänä on antaa teoriatietoa laboratoriotöiden tueksi. Kirjallinen osio antaa perustiedot DNA:n rakenteesta sekä-, DNA-replikaatiosta ja siinä käsitellään geeneihin ja mutaatioihin liittyviä ilmiöitä. Kirjallisessa osiossa perehdytään laktoosi-intoleranssiin sekä käsitellään reaaliaikaisen PCR:n periaatteita. Lisäksi avataan koestusprosessia, joka oli edellytyksenä työ- ja käyttöohjeen laadinnalle. Toimeksiantajan kanssa on sovittu, että työ- ja käyttöohjetta ei julkaista Theseuksessa.

Opinnäytetyön tavoite saavutettiin ja onnistuttiin luomaan uusi menetelmä sekä opetuskäytössä toimivat ohjeet työn suorittamiseksi. Tämä opinnäytetyö mahdollistaa jatkotutkimusaiheita uusille opinnäytetöille. Menetelmässä käytettävien DNA- ja eagenssikonsentraatioiden tarkempi optimointi voi toimia suorana jatkotutkimusaiheena tälle opinnäytetyölle.

Due to a mutation in one base of human genome, lactose tolerance evolved over time. However, there are substantial differences in the prevalence of lactose tolerance worldwide. The mutation connected to lactose tolerance is more present in areas where consumption of cow’s milk is an integral part of nutrition. To illustrate, some African and Asian peoples show a lactose intolerance rate as high as 90% of the population, whereas the corresponding proportion in Finland is only approximately 18%.

Different DNA tests are now among routine exams in basic health care, for example, in examining lactose intolerance. Many of the main methods in clinical laboratory analytics are based on real time polymerase chain reaction (RT-PCR). The aim of this thesis is to diversify the methods used in molecular biology education within the Biomedical Laboratory Science program at Tampere University of Applied Sciences, by enabling the use of RT-PCR methods, namely with the Applied Biosystems StepOnePlusTM PCR analyzer.

The thesis has two parts: the first part provides theoretical background for laboratory analytics and the second part consists of the work instructions and manual. The first part presents the basics of DNA structure and DNA replication, as well as different phenomena linked to the human genome and its mutations. It concentrates on the basics of lactose intolerance and on the principles of real-time PCR. Also, the first part discusses the testing process that was a prerequisite for producing the work instructions and manual. As per agreement with the company, the work instructions and manual will not be published on the Theseus platform.

The objectives set for the thesis were achieved: a new laboratory method was set up, and work instructions for Biomedical Laboratory Science students were produced. Further research on this method is now possible in future thesis projects. For example, a more precise optimization of the DNA and reagent concentration used in the method will provide a topic for continuing the research carried out in this thesis.