TRPA1-proteiinin tuotto ja karakterisointi Western blot -menetelmällä
Kukkonen, Meiju (2010)
Tampereen ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010060711620
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010060711620
Tiivistelmä
Ionikanavat ovat solukalvon läpäiseviä proteiineja, jotka kuljettavat ioneja soluun ja solusta ulos. Solun sisäistä kalsiumioni-pitoisuutta säätelevät muun muassa TRP-ionikanavat (transient receptor potential channel). TRPA1 (transient receptor potential ankyrin 1) on TRP-ionikanavaperheen uusin tunnistettu jäsen, jota esiintyy esimerkiksi hermosoluissa, ihon keratinosyyteissä ja synoviasoluissa. TRPA1:n on muun muassa todettu välittävän formaliini-indusoitua kipua sekä toimivan hengitysteiden hermosoluissa ärsykkeitä aistivana ionikanavana, joten sen uskotaan olevan potentiaalinen vaikutuskohde kivun ja yskän sekä mahdollisesti keuhkosairauksien lääkehoidossa.
Kehittämistehtävän tavoitteena oli tuottaa TRPA1-proteiinia ja karakterisoida tuotettu proteiini Western blot -menetelmällä. TRPA1-geenin sisältävää plasmidia monistettiin kompetenteissa E. coli –soluissa, jonka jälkeen eristetylle plasmidi-DNA:lle tehtiin restriktioanalyysi digestoimalla plasmidi-DNA ja analysoimalla digestiotuotteet agaroosigeelielektroforeesilla. TRPA1-proteiinin tuottamiseksi plasmidi-DNA transfektoitiin eukaryoottisoluihin, joista tuotettu TRPA1-proteiini eristettiin ja analysoitiin Western blot –menetelmällä.
TRPA1-geenin sisältävää plasmidi-DNA:ta onnistuttiin monistamaan bakteerisoluissa ja restriktiokartoituksella plasmidin todettiin olevan oikean kokoista sekä vahingoittumatonta. Plasmidi-DNA:ta transfektoitiin eukaryoottisoluihin ja transfektiotehokkuus fluoresoivalla transfektioindikaattorilla määritettynä oli hyvä. Transfektoidut eukaryoottisolut ilmensivät TRPA1-proteiinia, joka osoitettiin Western blot –määrityksellä. Kehittämistehtävä toteutettiin osana laajempaa TRPA1-tutkimusta, jossa voidaan hyödyntää kehittämistehtävässä saatuja tuloksia ja TRPA1-proteiinia sisältäviä näytteitä tutkimuksen edetessä. TRPA1:n ilmentymistä on tarkoitus tutkia myös lähetti-RNA tasolla reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR (RT-qPCR) –menetelmällä ja TRPA1:n funktiota on tarkoitus tutkia solumalleissa.
Kehittämistehtävän tavoitteena oli tuottaa TRPA1-proteiinia ja karakterisoida tuotettu proteiini Western blot -menetelmällä. TRPA1-geenin sisältävää plasmidia monistettiin kompetenteissa E. coli –soluissa, jonka jälkeen eristetylle plasmidi-DNA:lle tehtiin restriktioanalyysi digestoimalla plasmidi-DNA ja analysoimalla digestiotuotteet agaroosigeelielektroforeesilla. TRPA1-proteiinin tuottamiseksi plasmidi-DNA transfektoitiin eukaryoottisoluihin, joista tuotettu TRPA1-proteiini eristettiin ja analysoitiin Western blot –menetelmällä.
TRPA1-geenin sisältävää plasmidi-DNA:ta onnistuttiin monistamaan bakteerisoluissa ja restriktiokartoituksella plasmidin todettiin olevan oikean kokoista sekä vahingoittumatonta. Plasmidi-DNA:ta transfektoitiin eukaryoottisoluihin ja transfektiotehokkuus fluoresoivalla transfektioindikaattorilla määritettynä oli hyvä. Transfektoidut eukaryoottisolut ilmensivät TRPA1-proteiinia, joka osoitettiin Western blot –määrityksellä. Kehittämistehtävä toteutettiin osana laajempaa TRPA1-tutkimusta, jossa voidaan hyödyntää kehittämistehtävässä saatuja tuloksia ja TRPA1-proteiinia sisältäviä näytteitä tutkimuksen edetessä. TRPA1:n ilmentymistä on tarkoitus tutkia myös lähetti-RNA tasolla reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR (RT-qPCR) –menetelmällä ja TRPA1:n funktiota on tarkoitus tutkia solumalleissa.