Tn5-transposaasin tuotto, puhdistus ja aktiivisuuden määritys

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli tuottaa Tn5-transposaasia tutkimuskäyttöön. Opinnäytetyö suoritettiin Tampereen yliopiston alaisuudessa toimivassa BioMediTechissä Protein Dynamics -tutkimusryhmässä. Toimeksianto työhön tuli tutkijalta, joka halusi proteiinia käyttöönsä. Tavoitteena oli tuottaa proteiinia kolmessa eri solulinjassa, puhdistaa se käyttäen erilaisia menetelmiä sekä varmistaa tuotteen aktiivisuus.

Proteiinia koodaavan geenin sisältävä vektori transformoitiin kolmeen eri E. coli -solulinjaan. Proteiinin tuotto indusoitiin IPTG:llä. Solut hajotettiin sonikoimalla, joka perustuu ultraäänen käyttöön. Hajotetuista bakteerisoluista saostettiin DNA pois käyttäen PEI-menetelmää. Tn5-transposaasia tuottavaan geeniin oli lisättynä kitiiniä sitova alue (CBD), jonka avulla proteiini pystyttiin puhdistamaan affiniteettikromatografiaa käyttämällä. Puhdistuksen eri vaiheissa otettiin SDS-PAGE-näytteitä, joiden avulla pystyttiin seuraamaan prosessin onnistumista. SDS-PAGE-geelien avulla saatiin selville, mitkä fraktiot sisältävät puhdistettua proteiinia. Fraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin. Dialyysituotteista ajettiin uusi SDS- PAGE-geeli, proteiini konsentroitiin ja pakastettiin. Tn5-transposaasien aktiivisuuden määritys tehtiin muodostamalla Tn5-kompleksi, joka aktiivisena pystyy pilkkomaan DNA:ta. Plasmidi-DNA:n pilkkoutumista voitiin analysoida agaroosigeelielektroforeesin avulla.

Proteiinia saatiin tuotettua runsaasti toimeksiantajalle. Tuotetun proteiinin puhtaus oli SDS-PAGE-analyysien perusteella hyvä. Aktiivisuuden määrityksen perusteella voidaan sanoa, että Tn5-transposaasi on aktiivista. Lisäksi toimeksiantajan omat kokeet Tn5-transposaasin kanssa varmistivat sen aktiivisuuden.

Opinnäytetyöprosessia ei optimoitu ajanpuutteen vuoksi. Tuottovaiheessa inkubaatioaikoja voitaisiin vaihdella, sekä lämpökaappien lämpötiloja muokata. Käytettyjen reagenssien konsentraatioita voitaisiin vaihdella saantojen parantamiseksi. Puhdistuksen aikana kitiiniä voitaisiin käyttää enemmän ja inkubaatioaikaa voitaisiin pidentää. Aktiivisuuden määrityksessä lämpötilan vaikutusta Tn5-kompleksin ja pUC19-plasmidin välisessä reaktiossa voitaisiin tutkia tarkemmin. Jatkotutkimuksen kannalta olisi mielenkiintoista tutkia, kuinka kauan Tn5-kompleksilla kestää pilkkoa koko pUC19-plasmidi.

The aim of the thesis was to produce Tn5 transposase for further research needs. The thesis was performed in Protein Dynamics research group at BioMediTech-institute working under the University of Tampere. The assignment came from a researcher who wanted to use the protein in their own research. The purpose of this thesis was to express the protein by using three different cell lines, to purify the protein by using various methods and to determine the activity of the product.

The vector plasmid containing the Tn5 expressing gene was transformed into three different E. coli-cell lines. The expression of the protein was induced with IPTG. The cells were lysed with sonication, which bases on the usage of ultrasound. From the lysed cells, DNA was precipitated by using PEI-method. Chitin binding domain (CBD) had been added into the Tn5 transposase coding gene, which makes the target protein bind to the matrix of the chitin column, therefore making the purification with affinity chromatography possible. During the different steps of the purification process SDS-PAGE samples were taken, which helped determining that everything went as planned. The samples indicated which fractions included the purified protein. After the SDS-PAGE analysis, the Tn5 transposase containing fractions were pooled and dialyzed. The dialyzed products were analyzed with SDS-PAGE, concentrated and frozen in the freezer. Determining the Tn5 activity was done by creating Tn5 complexes, which cleave the pUC19 plasmid. By changing the concentration of the complex, the activity could be measured by using agarose gel electrophoresis (AGE). The higher the Tn5 complex concentration was the higher the cleavage of the pUC19 plasmid would be while time is a constant.

Plenty of protein was produced for the researcher. The purity of the protein was good based on the SDS-PAGE-analysis. Based on the activity measurement results it can be said that the protein is active. Additionally, results from researcher’s own research confirmed that the protein was active.

During the process, measurements were not optimized due to lack of time. During the expression, the incubation times and the temperatures could be modified in order to increase the yield. The concentrations of the reagents used could be different. During the purification, the amount of chitin and protein incubation time could be increased. During the determination of the activity, the effect of the temperature could be examined further. In terms of future research, it would be interesting to study how long it takes for the Tn5 complex to cleave the whole pUC19 plasmid.