Homogeenisen fosforylaatiomääritysmenetelmän kehittäminen tehoseulontaan
Tyvelä, Samuli (2019)
Tyvelä, Samuli
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019120324412
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019120324412
Tiivistelmä
Opinnäytetyössä käsitellään translaation jälkeisiin muokkauksiin kuuluvaa fosforylaatiota. Työssä kehitettiin sammutusresonanssienergiansiirtotekniikkaa (QRET) entsyymiaktiivisuuden määrittämiseen ja inhibiittorien testaamiseen kolmelle PIM-kinaasille. Tässä työssä kinaasit fosforyloivat substraattipeptidin, eli liittivät siihen fosfaattiryhmän, jolloin substraatti ei pystynyt kiinnittymään myöhemmin lisättyyn Eu+3 -merkattuun peptidiin. Eu-peptidien tehtävä on emittoida fluoresenssisignaaleja energian siirtona mittalaitteessa. Substraatin ollessa fosforyloitu se ei pystynyt suojaamaan Eu-peptidiä, jolloin näytteessä olevat sammuttajamolekyylit peittivät tämän emittoimat signaalit. Kun näytteisiin lisättiin inhibiittoria estämään entsyymin toimintaa, peptidipeptidi -sidos pääsi syntymään ja signaalit olivat korkeat. Menetelmää optimoitaessa inhibiittorit olivat staurosporiini ja DHPCC-9, joiden IC50 arvot laskettiin PIM-1:lle. Uusia inhibiittoreita testattaessa staurosporiini ja DHPCC-9 toimivat kontrolleina.
Opinnäytetyössä tutkittuja PIM-kinaaseja on löydetty suurissa määrin syöpäsoluista kuten leukemiasta. Niiden on todistettu vaikuttavan moneen syövän kasvamisen ja jakaantumisen kannalta tärkeään toimintoon, jonka takia niille selektiivisen lääkeaineen etsiminen on varteenotettava tutkimuskohde. Opinnäytetyössä käytettyä menetelmää optimoitiin tehoseulontaa (HTS) varten, jonka tarkoituksena on suurten lääkeainemäärien testaaminen kohdemolekyylille. Menetelmä onnistuttiin optimoimaan yhdelle PIM-entsyymeistä kohtalaisen hyvin. Menetelmän kehitystä pitäisi kuitenkin jatkaa, jotta se saataisiin toimimaan kaikille kolmelle samanaikaisesti. This thesis is about studying phosphorylation, which is a post-translational modification. Quenching resonance energy transfer (QRET) was developed for measuring enzyme activity and to screen potent inhibitors for three PIM kinases. In the thesis kinases were used to phosphorylate substrate peptides by attaching phosphates to them, which prevented the substrates from binding to Eu +3 -labeled peptides. The Eu-labeled peptides emit fluorescence signals by energy transfer. In this setting quenching molecules in the samples blocked the labeled peptides’ emitted signals because the phosphorylated substrates could not form peptide-peptide bonds. When the substrates are able to bind with the Eu-peptides they keep the quenchers far enough for observable signals to be emitted. Inhibitors were added to the samples to block the enzymes from phosphorylating, which allowed the peptides to bind and high signals were measured. In the assay optimization staurosporine and DHPCC-9 were used as inhibitors. They were used as controls when testing potential new inhibitors for PIM kinases and their IC50 values were calculated for PIM-1 during the optimization.
PIM kinases studied in this thesis have been found in large concentrations from for example leukemia tumor cells. They have been shown to play major roles in some of the cancer’s essential functions such as its cell cycle regulation and proliferation, which makes it a relevant target for drug discovery. The assay optimized in this thesis was developed for high-throughput screening (HTS) as it is a common method in the industry for testing large quantities of potential molecules. The assay was optimized moderately well for one of the PIM enzymes, PIM-1. The development of the assay should be continued to make it suitable for all three PIM kinases simultaneously.
Opinnäytetyössä tutkittuja PIM-kinaaseja on löydetty suurissa määrin syöpäsoluista kuten leukemiasta. Niiden on todistettu vaikuttavan moneen syövän kasvamisen ja jakaantumisen kannalta tärkeään toimintoon, jonka takia niille selektiivisen lääkeaineen etsiminen on varteenotettava tutkimuskohde. Opinnäytetyössä käytettyä menetelmää optimoitiin tehoseulontaa (HTS) varten, jonka tarkoituksena on suurten lääkeainemäärien testaaminen kohdemolekyylille. Menetelmä onnistuttiin optimoimaan yhdelle PIM-entsyymeistä kohtalaisen hyvin. Menetelmän kehitystä pitäisi kuitenkin jatkaa, jotta se saataisiin toimimaan kaikille kolmelle samanaikaisesti.
PIM kinases studied in this thesis have been found in large concentrations from for example leukemia tumor cells. They have been shown to play major roles in some of the cancer’s essential functions such as its cell cycle regulation and proliferation, which makes it a relevant target for drug discovery. The assay optimized in this thesis was developed for high-throughput screening (HTS) as it is a common method in the industry for testing large quantities of potential molecules. The assay was optimized moderately well for one of the PIM enzymes, PIM-1. The development of the assay should be continued to make it suitable for all three PIM kinases simultaneously.