Mikrobien cDNA:n synteesin automatisointi ribosomaalisesta RNA:sta

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Jyväskylän yliopiston bio- ja ympäristötieteiden laitokselle. Työ oli osana laa-jempaa projektia, jonka tavoitteena on kehittää automatisoitu mikrobiologinen laadunvalvontatesti teollisuusprosesseihin. Projektin koordinoijana toimii akatemiatutkija Marja Tiirola Jyväskylän yliopiston bio- ja ympäristötieteiden laitokselta.

Opinnäytetyön tavoitteena oli saada automatisoitu RNA:n eristysmenetelmä Thermon Scientific KingFisher -magneettipartikkelirobotilla. Laitteella oli tarkoitus tehdä cDNA synteesi lysatoidulle E. colille. Tutkimuksessa E. coli -pelletit homogenisoitiin 70 %:ssa etanolissa FastPrepillä. Homogenisoinnin jälkeen E. coli -lysaatit puhdistettiin KingFisher-robotilla. Puhdistetuille tuotteille tehtiin kään-teistranskriptio, jolloin yksijuosteisesta RNA:sta muodostui kaksijuosteista komplementaarista DNA:ta, cDNA:ta. Käänteistranskription jälkeen tuotteessa vielä jäljellä oleva alkuperäinen RNA poistettiin ribonukleaasi I (RNase I) -käsittelyllä.

Tutkimuksen perusteella paras kokonaisuus käänteiskopioitaessa RNA-fragmenttia oli seuraavanlainen: reaktiolämpötila oli 55 oC ja entsyyminä käytettiin RevertAidin Premium käänteistranskriptaasia. Lämpötilaohjelmassa lämpötila nostettiin ensin 65 oC:een, laskettiin sen jälkeen 10 oC:een ja vasta sitten lämpötila nostettiin reaktiolämpötilaan. Näin saatiin hajotettua RNA:n sekundäärirakenteet ja käänteistranskriptio onnistui paremmin. Käänteistranskription jälkeen RT-tuotteelle tehtiin RNase I -käsittely ja sopiva RNase I:n määrä käsittelyyn oli 0,3 µl.

Pelkkä Thermon KingFisher -magneettipartikkelirobotilla tehtävä puhdistus jätti tuotteeseen liikaa epäpuhtauksia. Epäpuhtaudet estivät käänteistranskriptioreaktion, joten epäpuhtaudet oli poistettava ennen Thermon KingFisher -robotilla tehtävää puhdistusta. Tässä tutkimuksessa epäpuhtaudet poistettiin fenoliesikäsittelyllä. Fenolikäsittelyn jälkeen entsymaattiset reaktiot onnistuivat hyvin.

This Bachelor`s Thesis was made for the Department of Biological and Environmental Science of the University of Jyväskylä. This Thesis was a part of a larger project the aim of which was to de-velop an automated microbiological quality control test for the industrial processes. Academy researcher Marja Tiirola from the Department of Biological and Environmental Science of the University of Jyväskylä acts as coordinator of this project.

The aim of this Thesis was to create an automated RNA isolation protocol for Thermo´s Scientific KingFisher magnetic particle processor. In the research E. coli pellets were homogenized in 70% EtOH by FastPrep and after that homogeneous E. coli was purified by KingFisher-robot. Purified products were transcribed and then single stranded RNA turned into double stranded comple-mentary DNA, cDNA. After the transcription there was still original RNA left in the product which was removed from the product by ribonuclease I (RNase I) –treatment.

Based on the research the best way to transcribe RNA is the following: the reaction temperature was set to 55 degrees centigrade and the enzyme used in the reaction was RevertAid Premium. The temperature was programmed so that it first rose to 65 degrees centigrade, then fell to 10 degrees centigrade and finally rose to the reaction temperature of 55 degrees centigrade. RNase I -treatment was made to the product after the transcription and a suitable amount of RNase I for the treatment was 0,3 µl.

After the purification just by Thermo´s KingFisher robot, too much impurity was left in the product. Transcription did not work because of the impurity in the product therefore the impurity had to be removed before the purification by the KingFisher-robot. In this research phenol was used to remove the impurity and after the phenol treatment enzymatic reactions succeeded.