Evaluation of extracellular nucleotide turnover in vascular endothelial cells under normal and hypoxic states

Abstract

This bachelor`s thesis was commissioned by Sirpa Jalkanen`s research group which is part of the Faculty of Medicine in the University of Turku. The research group is focused on studying leukocyte trafficking and adhesion. Besides working as intracellular energy molecules,nucleotides such as ATP and ADP also act as extracellular signaling molecules in various tissues and organs. Especially ATP is involved in several physiological and pathological functions serving for instance as a pro-inflammatory agent. Cells release purines and pyrimidines to the extracellular milieu as a result of various stress conditions such as decreased oxygen level (hypoxia). Hypoxia is known to be linked with the formation of new blood vessels (angiogenesis), thereby contributing to the increased incidence of cancer. The aim of this thesis was to study the effects of acute hypoxia (4-24 h; 1% O2) on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). In addition, the effects of one hour re-oxygenation after hypoxia were studied. Results were compared with cells cultured under normal oxygen supply at body temperature. The activities of the nucleotide-converting ecto-enzymes were determined with a thin layer chromatography (TLC) using 3H- labelled substrates. The tyrosine kinase phosphorylation status of the cells was studied by Western Blot analysis and immunofluorescence staining. The concentrations of extracellular ATP and ADP were determined with a bioluminescent approach based on luciferin-luciferase reaction. According to the results, acute hypoxia did not have any significant effect on the extracellular nucleotide levels while the phosphorylation status of HUVECs was diminished. Interestingly, endothelial ecto-nucleotidase activities were slightly up-regulated during hypoxic exposure and in addition, the counteracting ATP-regenerating pathway was concurrently activated.

Tämän opinnäytetyön toimeksiantajana oli Sirpa Jalkasen tutkimusryhmä, joka on osa Turun yliopiston lääketieteellistä tiedekuntaa. Tutkimusryhmä on keskittynyt tutkimaan erityisesti leukosyyttiliikennettä ja adheesiota. Solun ulkopuoliset nukleotidit, kuten ATP ja ADP toimivat sekä solun sisäisinä energiamolekyyleinä, että solun ulkopuolisina signalointimolekyyleinä useimmissa kudoksissa ja elimissä. Etenkin ATP on osallisena useissa fysiologisissa ja patologisissa tehtävissä toimien esimerkiksi tulehdusta edistävänä tekijänä. Solut vapauttavat puriineja ja pyrimidiinejä solun ulkopuoliseen tilaan mm. erilaisten stressitilojen, kuten vähentyneen hapen määrän eli hypoksian vaikutuksesta. Useissa tutkimuksissa hypoksian on todettu olevan yhteydessä uusien verisuonten muodostumiseen eli angiogeneesiin ja siten myös syövän syntyyn. Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia akuutin hypoksian (4-24 h; 1% O2) seurauksia ihmisen napanuoran laskimon endoteelisoluissa (HUVEC). Myös hypoksian jälkeisen toipumisen vaikutuksia tutkittiin (1 h). Tuloksia verrattiin solun normaaliin hapensaantiin ruumiinlämpötilassa. Nukleotideja muuntavien ektoentsyymien aktiivisuudet määritettiin 3H- leimattujen substraattien avulla käyttäen ohutlevykromatografiaa (TLC). Solujen tyrosiinikinaasifosforylaatiostatusta analysoitiin Western Blot -analyysin ja immunofluoresenssivärjäysten avulla. Solun ulkopuolelle vapautuvien ATP:n ja ADP:n konsentraatiot määritettiin bioluminesenssipohjaisella menetelmällä, joka perustuu lusiferiini-lusiferaasireaktioon. Tulosten mukaan akuutilla hypoksialla ei ollut merkittäviä vaikutuksia solun ulkopuolisiin nukleotidipitoisuuksiin. Lisäksi solujen fosforylaatio väheni akuutin hypoksian vaikutuksesta. Mielenkiintoista oli, että endoteelin ekto-nukleotidaasiaktiivisuudet lisääntyivät hieman hypoksian seurauksesta ja ATP:a muodostavan mekanismin todettiin olevan aktivoitunut.