Oktopamiinireseptorisolulinjat : solulinjojen kartoitus ja LANCE cAMP-menetelmän optimointi

Abstract

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli oppiaineen laboratoriossa kehitettyjen oktopamiinireseptorisolulinjojen ominaisuuksien kartoitus ja cAMP-määritysmenetelmän optimiolosuhteiden mää¬rittely. Oktopamiinireseptorien geenit oli transfektoitu CHO-soluihin, jotka oli täten saatu ilmentämään viittä eri oktopamiinireseptoria, alatyyppejä R0, R1, R2, R3 ja R4. Reseptorigeenit oli eristetty merirokosta (Balanus improvisus), joka on meressä elävä niveljalkainen eläin. Jokaisesta oktopamiinireseptoria ilmentävästä solulinjasta oli valmistettu kolme rinnakkaista linjaa. Lisäksi oli samalla tavalla valmistettu solulinjat, jotka tuottivat fuusioproteiineja, joissa reseptoriin oli liitetty fluoresoiva merkkiaine, GFP-peptidi. Reseptorien tutkimus suoritettiin reseptorien toimintaa mittaavalla menetelmällä PerkinElmerin LANCE® cAMP-kittiä käyttäen, koska oktopamiinireseptoreille ei ole sopivaa radioligandia, jolla reseptorien määrää ja farmakologisia ominaisuuksia voitaisiin kätevästi tutkia. LANCE-menetelmä perustuu cAMP:n pitoisuuden mittaamiseen aikaerotteisella fluoresenssilla. cAMP-menetelmä optimoitiin solumäärän ja stimulaatioajan suhteen. Määritykset tehtiin elävillä soluilla. Tärkeänä osana työtä oli huolehtia solujen elinvoimaisuudesta hoitamalla soluja aktiivisesti koko tutkimuksen ajan. cAMP-metelmällä pystyttiin hyvin karakterisoimaan oktopamiinireseptorisolulinjat ja löytämään niistä parhaimman vasteen tuottavat alapopulaatiot. cAMP-menetelmä osoittautui luotettavaksi, toistettavaksi ja käyttökelpoiseksi niille reseptoreille, joiden kytkeytyminen adenylaattisyklaasin aktiivisuuden säätelyyn oli tehokas CHO-soluissa. Tämä opinnäytetyö on tehty Turun yliopiston lääketieteellisessä tiedekunnassa Biolääketieteen laitoksen farmakologian, lääkekehityksen ja lääkehoidon oppiaineessa Mika Scheininin tutkimusryhmässä.

The purpose of this work was to characterize cell lines expressing recombinant octopamine receptors and to determine the optimal assay conditions for the employed Lance cAMP kit. Octopamine receptor genes had been transfected into CHO cells for production of five different octopamine receptor subtypes, R0, R1, R2, R3 and R4. The receptor genes had been isolated from a marine arthropod, the barnacle Balanus improvisus. Three parallel cell lines had been made for each receptor. In addition, another set of cell lines expressed receptors tagged with a fluorescent marker, GFP. The work was performed using a functional receptor activation assay based on PerkinElmer’s LANCE® cAMP kit, because no suitable radioligand exists for the characterization of octopamine receptors. The cAMP assay is based on measurement of time-resolved fluorescence resonance energy transfer. The cAMP assay was optimized for cell number and stimulation time. The assays were performed with living cells. An important part of this work was to take care of the cells by actively culturing them during the project. With the cAMP assay, it was possible to characterize octopamine receptor cell lines and to find which of the cell lines produced the best responses. The cAMP assay emerged as reliable and reproducible for those cell lines where the receptors are efficiently coupled to regulation of adenylyl cyclase activity. This thesis project has been carried out at the University of Turku, Faculty of Medicine, Institute of Biomedicine, in its Department of Pharmacology, Drug Development and Therapeutics, in the research group of Professor Mika Scheinin.