Virusvasta-aineiden seulonta synteettisistä vasta-ainekirjastoista

Abstract

Coxsackievirus A7 (CAV7) ja coxsackievirus A9 (CAV9) ovat molemmat pikornaviruksiin kuuluvia, ihmiselle tautia aiheuttavia enteroviruksia. CAV7 on aiheuttanut muun muassa. aivokalvontulehdusta ja halvausepidemioita, mutta on nykyisin melko harvinainen. CAV9 on yleinen ihmispatogeeni, joka aiheuttaa lievien hengitystieinfektioiden lisäksi muun muassa sydänlihas- ja aivokalvontulehduksia.

Tämän työn tarkoituksena oli optimoida enterovirusten puhdistusmenetelmää ja tarkastella viruksen saantoa puhdistuksen eri vaiheissa sekä käyttää puhdistettuja viruksia faagi-vasta-aineiden seulonnassa synteettisistä scFv-kirjastoista.

Viruspuhdistuksessa sovellettiin ultrasuodatusta viruksen osittaiseen puhdistukseen ja konsentrointiin perinteisemmän PEG-saostuksen ja CsCl-gradienttiajon rinnalla. Puhdistuksen eri vaiheista kerättiin näytteitä, joiden infektiivisyys määritettiin soluilla ja puhtaus geelillä. Saatujen tulosten perusteella havaittiin, että ultrasuodatus nopeuttaa viruspuhdistusprosessia, kun tarvitaan mahdollisimman infektiivistä viruspreparaattia ja virus on suhteellisen puhdasta ultrasuodatuksen jälkeen.

Vasta-aineseulonnassa CAV9:lle ei onnistuttu löytää hyviä sitojia vasta-ainekirjastosta, jolloin päätettiin muutamien selektioiden jälkeen keskittyä ainoastaan CAV7:aan. CAV7:lle löydettiin muutamia hyviä sitojia, joita voisi jatkossa rikastaa uusilla pännäyskierroksilla. CAV7:lle löydettyjä sitojia voisi puhdistaa vasta-aineen testauksia varten. Pikornavirusvasta-aineita voitaisiin ylipäänsä testata elävissä soluissa in vitro tai hiirissä in vivo, muun muassa neutralisaatiotesteillä ja kokeilla siten virusinfektion estoa. Humaanivasta-ainekirjastot mahdollistavat virusvasta-aineiden käytön myös ihmisissä.

Coxsackievirus A7 (CAV7) and coxsackievirus A9 (CAV9) are both members of the genus Enterovirus in the family Picornaviridae. CAV7 has caused meningitis and flaccid paralysis but today it is a rare type. CAV9 causes respiratory infections but also meningitis and myocarditis.

The objective of this study was to optimize enterovirus purification and examine virus yield during the purification process. Purified viruses were used in binder selection against phage display antibody library.

Coxsackievirus A9 was purified using PEG concentration and on cesium chloride gradient centrifugation, and followed by dialysis of virus bands. Ultrafiltration was also tested in virus concentration and purification. Samples were collected from each purification step, infectivity was tested on cells and purity was checked by SDS-PAGE. PEG concentration resulted in significant loss of particle infectivity. It was found that the total amount of recovered virus in the ultrafiltrated concentrate was somewhat greater than in the ultracentrifuged virus preparation.

Phage scFvs were obtained after three rounds of selection against immobilized virus antigen. The phage scFv gave low enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) values with CAV9. So in further studies studies concentrated only on CAV7. A few good binders against CAV7 were isolated from phage display library. In the future CAV7 binders could be enriched and purified for antibody testing. Binding and ability to neutralize virus infection by picornavirus antibodies could generally be tested in vitro on live cells or in vivo in mice. In general human antibody libraries enable the use of virus antibodies in humans.