RCA -menetelmän hyödyntäminen geenikirjastojen kehittämisessä

Abstract

Geenikirjastojen kokoa rajoittava tekijä on DNA:n transformaatio bakteereihin. Transformaatiota saadaan tehostettua lisäämällä DNA:n määrää. Silmukoimismenetelmän (RCA) avulla rengasmaista DNA:ta voidaan monistaa suuria määriä transformaatiota varten. Ongelmakohtana on kuitenkin RCA:n tuotteena syntyvän DNA-konkatameerin muokkaus transformoitavaan muotoon.

Perinteisesti tämä tehdään digestoimalla DNA-konkatameeri yhden perusyksikön pituisiksi juosteiksi ja liittämällä ne itsensä kanssa. Toinen kokeellisempi menetelmä on rekombinaation hyödyntäminen konkatameerin silmukoimisessa perusyksiköiksi. Tämän työn tarkoituksena oli vertailla menetelmien tehokkuuksia sekä optimoida digestio-ligaatio ja rekombinaatio-menetelmät mahdollisimman hyvän monistetun DNA:n transformaatiotehokkuuden saavuttamiseksi

Työssä kloonattiin cre-rekombinaasin tunnistuselementtinä toimiva LoxP kohdeplasmidiin. Tämän jälkeen monistettiin plasmidia RCA -menetelmällä ja testattiin entsyymi- ja DNA-konsentraatioiden sekä reaktioajan vaikutusta konkatameerin uudelleenjärjestämisessä transformoitavaan muotoon. Reaktioiden onnistumista seurattiin agaroosigeelielektroforeesin ja bakteeritransformaatioiden avulla.

Työssä havaittiin, että hypoteesi osui oikeaan ja rekombinaatiomenetelmä toimi paremmin kuin perinteinen menetelmä. Plasmidilla pIX/PAK100r-LoxP1 digestio- ligaatio-menetelmä tuotti pesäkkeen muodostavia yksiköitä 10 ng RCA reaktioseosta kohden 4,54E+07, kun rekombinaatio-menetelmällä päästiin 1,19E+08 määrään.

DNA transformation to bacteria is a size-limiting factor in the construction of gene libraries. By increasing the DNA amount, the transformation can be enhanced. By rolling circle amplification (RCA), circular DNA can be replicated in large quantities for the transformation. However, the RCA product is a concatemer and has to be re-circularized for more efficient transformation.

Traditionally, re-circularization has been done by digesting the DNA concatemer into monomer units and ligating them with themselves. One alternative method is the use of recombination for circularization of the concatemer into basic units. The purpose of this study was to compare the methods and to optimize digestion-ligation and recombination to achieve the most optimal transformation efficiency.

In this thesis, the cre- recombination element tag LoxP was cloned to a target plasmid. Subsequently, the plasmid was amplified by the RCA method, and the effect of enzyme and DNA concentrations and reaction time was tested. The reactions were monitored by agarose gel electrophoresis and transformation to bacteria.

It was observed that the hypothesis was correct, and recombination worked better than the traditional method. The digestion-ligation method yielded 4.54E+07 cfu/ 10 ng of RCA reaction mixture while recombination produced 1.19E+08 cfu/ 10 ng RCA reaction mixture with plasmid pIX/PAK100r-LoxP1.