Kryosäilytysmenetelmän kehittäminen pensashanhikeille

Abstract

Työn tavoitteena oli kehittää käyttökelpoinen kryosäilytysmenetelmä pensashanhikeille (Dasiphora fruticosa (L.) Rydb.). Opinnäytetyö tehtiin Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskuksella (MTT) Laukaassa. Laukaan toimipaikka kuuluu Kasvintuotannon tutkimus -yksikköön. Kryosäilytys eli nestetyppeen säilyttäminen tuli tarpeelliseksi, kun toimeksiantajan tuotannosta oli poistumassa kaksi pensashanhikkilajiketta ja niiden säilyttäminen kasvihuoneilla tai mikroviljelminä olisi aikaa ja tilaa vievää.

Menetelmän optimoimiseen käytettiin neljän eri pensashanhikkilajikkeen in vitro -solukkoviljelmistä eristettyjä silmuja. Koska Laukaassa on käytössä pisara-vitrifikaatio-menetelmä vadelmalla ja mansikalla, pensashanhikille kokeiltiin aluksi vadelma- ja mansikka-menetelmiä mukailevia menetelmiä ja lisäksi myöhemmin muutamia uusia menetelmiä, jotta paras menetelmä saataisiin valittua käyttöön. Optimoitavia muuttujia olivat menetelmän valinnan lisäksi silmun tyyppi ja koko, aktiivihiilen käyttö alustassa, sokerikäsittelyt, silmujen eristämispäivä ja tärkeimpänä vitrifikaatiokäsittely eli käsittelyaika vitrifikaatioliuoksissa.

Työssä käsiteltiin kaikkiaan 20 erisuuruista koesarjaa ja eristettiin noin 1500 silmua. Silmut eristettiin joko maanantaina tai perjantaina. Maanantaina eristetyt silmut käsiteltiin pääasiassa mansikalle kehitellyn menetelmän mukaisesti ja perjantaina eristetyt silmut taas vadelmalle kehitellyn menetelmän mukaisesti. Paras lopputulos saavutettiin käyttämällä vadelmalle kehitettyä menetelmää mukailevaa pisara-vitrifikaatio-menetelmää, jossa otettiin kuitenkin 2–3 mm pitkiä kärkisilmuja. Silmujen koko ja tyyppi poikkesivat vadelmilla käytetyistä 0,5–2 mm pitkistä hankasilmuista. Silmuille annettiin kolmen päivän mittainen aktiivihiilikäsittely ja kokeiltiin menestyksellisesti alempaa sokeripitoisuutta kuin vadelmalle käytetyssä menetelmässä. Vitrifikaatiokäsittelyssä parhaaseen tulokseen päästiin 60 minuutin PVS2-käsittelyajalla. Mansikalle kehitelty pisara-vitrifikaatio-menetelmä ei toiminut kaikilla pensashanhikeilla, minkä vuoksi sitä ei voida käyttää kryosäilytysmenetelmänä pensashanhikkeja säilytettäessä. Täydentävistä menetelmätestauksista saatiin selville, että pensashanhikit vaativat aktiivihiilikäsittelyn, mutta vadelmalle kehitetyssä menetelmässä käytetty korkea sokeripitoisuus oli pensashanhikeille haitallinen. Pensashanhikeille saatiin kehiteltyä uusi, toimiva menetelmä, joka voitiin ottaa käyttöön.

The aim of this work was to develop a functioning cryopreservation method for shrubby cinquefoil (Dasiphora fruticosa (L.) Rydb.). This thesis was carried out in MTT Agrifood Research Finland at Laukaa. The office of Laukaa is part of the Plant Production Research unit. Cryopreservation (preservation in liquid nitrogen) became necessary as two shrubby cinquefoil cultivars were cut out from the production. The maintenance of cultivars in a greenhouse or as in vitro cultures would be time and space demanding.

To optimize the method, buds isolated from four in vitro cultures of shrubby cinquefoil were used. Since the droplet vitrification method is used at Laukaa for raspberry and strawberry, it was also tried out with shrubby cinquefoil. At first the methods that are in use with raspberry and strawberry were tested. In addition, some new methods were tried out. The best method would be taken into use. Variables that had to be optimized were the method selection, the bud type and size, the use of activated charcoal in the culture medium, sugar treatments, bud isolating days and as most important of all the vitrification treatment and times of treatments in vitrification solutions.

In this work 20 test series of different sizes were processed and about 1500 buds were isolated. The buds were isolated either on Monday or on Friday. The buds isolated on Monday were mainly treated with the method developed for strawberries and the buds isolated on Friday were mainly treated with the method developed for raspberries. The best final result was reached by using the adapted droplet vitrification method that is developed for raspberry, but using apical buds of 2–3 mm length. It was different than in the method developed for raspberry where lateral buds of 0.5–2 mm length are being used. The buds were precultured in a culture medium with activated charcoal for three days and a lower sucrose concentration than used for raspberry method was successfully tried. In the vitrification treatment, the best result was obtained with 60 minute PVS2-treatment time. The method developed for strawberry did not work out with all shrubby cinquefoil cultivars and therefore it can not be used as cryopreservation method for them. From supplementary method testing it was obtained that shrubby cinquefoil needed an activated charcoal treatment, but the sucrose concentration used for raspberries was too high for it. A new, workable method was developed and could be taken into use.