PCR-menetelmän optimointi, standardien kehittäminen ja potilasnäytteiden analysointi

Abstract

Tämän työn tarkoituksena oli optimoida reaaliaikainen PCR- reaktiomenetelmä, jolla saataisiin määritettyä potilasnäytteestä samanaikaisesti kolme influenssavirusta ja RS-virus. PCR-reaktiot suoritettiin RotorGene – laitteilla. Reaktioita tarkasteltiin aluksi Boxto-värillä virusten kolmois-, neli- ja yksittäisseoksilla. Lopulliset PCR-reaktiot tehtiin kahden influenssaviruksen ja RS-viruksen kolmoisseoksilla sekä kunkin viruksen yksittäisseoksilla koettimen mukana olleessa. Lisäksi työssä kehitettiin influenssa A(H1N1)2009 virukselle sekä influenssa A-viruksille sopiva yleispätevä kopiolukustandardi. Standardimolekyylejä varten vertailtiin yleisimmin esiintyviä influenssavirusten kantoja. Influenssa A-viruksen standardimolekyyli valmistettiin eristämällä PCR-reaktiossa suunniteltujen alukkeiden avulla 889 bp:n pituinen DNA-jakso viruksen M-geenistä. Pandeemisen (H1N1)-viruksen standardimolekyyli eristettiin viruksen H-geeniin alueelta (902 bp:n pituinen DNA-molekyyli) samoja menetelmiä käyttämällä H1N1-virukselle spesifisiä alukkeita käyttäen. Saadut DNA-molekyylit kloonattiin plasmidivektoriin ja monistettiin standardimolekyylivektorit transformoimalla ne E.coliin. Lopuksi monistetut plasmidimolekyylit eristettiin bakteerista ja varmistettiin standardimolekyylien oikeellisuus ja toimivuus PCR-reaktiossa. Työssä tarkistettiin influenssa A(H1N1)2009 suhteen laboratorioon tutkittaviksi saapuneita näytteitä. Tarkastettavien näytteiden otos oli 124 näytettä ja tarkastettavana kohteena oli alle 12-vuotiaiden lasten ryhmä. Potilasnäytteitä tutkittiin 12 respiratorisen viruksen kaupallisella multi-plex DPO- (Dual Priming Oligonucleotide) alukkeita hyödyntävällä multiplex PCR-menetelmällä ja saatuja viruslöydöksiä arvioitiin suhteessa influenssaepidemiaan.

The purpose of this thesis was to optimize PCR method for three influenza viruses and the RS-virus. The PCR reactions were run on RotorGene devices. First the PCR reactions were analysed with dsDNA dye BOXTO in double, triple and fourfold PCR reaction mixes. Finally, reactions with specific probes in different multiplex combinations were compared with separate reactions for each virus. In this thesis standard molecules of the influenza A/H1N1 viruses and influenza A virus were created. For standards, the most prevalent influenza virus strains were compared. The standard molecule for influenza A was prepared by amplifying a 889 bp sequence of influenza A M gene by PCR. The standard molecule of the pandemic influenza A/H1N1 virus was isolated from the H gene (902 bp) of the influenza A/H1N1 virus the same way as the M gene standard but using primers specific for H1N1. The DNA molecules were cloned into the plasmid vector and transformed into E.coli. Finally, multiplied recombinant DNA plasmids were isolated from bacteria and tested by PCR for their accuracy and functionality. In this thesis patient samples were examined for influenza A/H1N1. For the examination 124 samples were chosen from children under the age of 12. Patient samples were studied for the presence of 12 respiratory viruses by a commercial multiplex PCR with DPO (Dual Priming Oligonucleotide) primers and the total virus findings were analyzed in relation to the influenza outbreak.