Kromatografialaitteiston käyttöönotto ja testaus

Abstract

Opinnäytetyön aiheena oli kromatografialaitteiston käyttöönotto ja testaus. Toimeksiantajana oli Turun ammattikorkeakoulu. Opinnäytetyön tavoitteena oli ottaa kromatografialaite käyttöön, kehittää toimiva puhdistusmenetelmä kohdeproteiinille, laatia käyttöohje ja ohjata opiskelijoita käyttämään kromatografialaitetta laboratoriossa.

Työssä käsiteltiin sekä kromatografialaitteen että proteiinipuhdistusmenetelmien ominaisuuksia ja käytettäviä analyyseja. Aluksi kromatografialaitteisto asennettiin ja testattiin käyttökuntoon ennen proteiinipuhdistusmenetelmän kehitystyötä. Kromatografialaitetta käytetään biomolekyylien erottamiseen ja puhdistamiseen. Opinnäytetyön kohdeproteiini on monomeerinen mEGFP (monomeric enhanced green fluorescence protein), tehostettu vihreää fluoresoiva proteiini, joka on eristetty Aequorea Victoria -meduusasta.

Kohdeproteiinin puhdistuksessa käytettiin anioninvaihtomatriiseja. Anioninvaihtokolonnissa on positiivisesti varautunut ja sitoo negatiivisesti varautuneita proteiineja. Puhdistusmenetelmän kehitystyössä käytettiin Tris- ja Bis-Tris-propaanipuskureita. Automaattisen puskurisekoitusoption (buffer blending) toimivuutta testattiin myös kehitystyön aikana. Tämän lisäksi vertailtiin valmiiden puskureiden toimivuutta. Kokemuksen mukaan puskurisekoitustoiminto sopii tutkimustyöhön, mutta rutiiniajoissa valmiiden puskurien käyttö on suositeltava. Kehitystyön aikana tehtiin myös proteiinipitoisuus- ja fluoresenssianalyyseja. Näiden lisäksi suoritettiin geelielektroforeesiajoja lopputuotteiden koon ja puhtauden tarkastamiseksi. Näiden analyysien avulla pystyttiin toteamaan puhdistusmenetelmän tehokkuus. Opinnäytetyön loppuvaiheessa opiskelijat opastettiin käyttämään kromatografialaitetta laboratoriossa.

Opinnäytetyön tuloksien tarkastelussa käsiteltiin puskurisekoitusoption toimivuutta, eri puhdistusmenetelmien soveltuvuutta ja tulosten luotettavuutta. Tulosanalyysin perusteella todettiin, että Tris-puskurilla ja Q Sepharose XL -anioninkolonnilla saadaan kohdeproteiini puhdistettua tehokkaasti.

This thesis concerns the commissioning and testing of chromatograph. The objective of the thesis was to commission the chromatograph, to develop a purification method for the target protein, to create instructions, and to guide students to use the chromatograph in the laboratory.

The features of the chromatograph were studied, the purification method was developed and analyses were performed in the practical phase of the thesis project. At the beginning, the chromatograph was installed and tested before the developing of the purification method. Chromatograph is used to separate and purify biomolecules. The target protein of the thesis is a monomer enhanced green fluorescence protein, or mEGFP, isolated from a jellyfish (Aequorea Victoria).

Anion exchange matrixes were used to purify the target protein. In the anion exchange technique, the column contains the positively charged matrix that has the ability to bind to the negatively charged proteins. Tris and Bis-Tris propane were used as a buffer in the development of the purification method. The functionality of the buffer blending was tested and ready-to-use buffers were also used in the thesis. Based on the findings, the buffer blending function of the chromatograph is suitable in research use, but the ready-to-use buffers are more recommended in routine use. The protein assay and the measurement of fluorescence were performed during the development of the purification method. The size and the purity of the final products were analyzed by using the gel electrophoresis technique. The efficiency of the purification methods can be confirmed by using these analyses. At the end of the thesis project, students were instructed on how to use the chromatography in the laboratory.

The functionality of the buffer blending, the suitability of the purification methods and the reliability of the results were discussed. According to the analyses, the target protein was purified efficiently by using Tris buffer and a Q Sepharose XL matrix.