In vitro -määrityksen kehittäminen β-amyloidien aggregaation havaitsemiseen

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää uusi menetelmä β-amyloidien aggregaation havaitsemiseen. Opinnäytetyö suoritettiin Turun yliopiston biolääketieteen laitoksella osana projektia, jossa kehitettiin nanopartikkeliperusteista, epäspesifistä menetelmää Alzheimerin taudin tutkimukseen.

Menetelmä perustui aikaerotteisen fluoresenssin resonanssienergian siirron havaitsemiseen. Määrityksessä akseptorina toimivat Alexa Fluor 680 -värillä leimatut gammaglobuliinit kilpailivat β-amyloidien tai β-amyloidiaggregaattien kanssa adsorboitumisesta donorina toimivien Eu(III)-nanopartikkelien pinnalle. Energiansiirtosignaalin suuruus muuttui suhteessa adsorboituneen leimaproteiinin määrään.

Työssä pyrittiin optimoimaan mittausolosuhteita sekä tutkimaan, miten eri olosuhteet vaikuttivat β-amyloidien aggregoitumiseen ja miten se näkyi mitattavassa signaalissa. Lisäksi testattiin inkubointiajan vaikutusta β-amyloidien aggregoitumiseen. Käytettyjä laimennusliuoksia olivat dimetyylisulfoksidi, Ham´s F-12 -medium, fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 10 mM suolahappo, suolaliuos (10 mM HCl, 150 mM NaCl) ja vesi. Työssä tutkittiin myös kurkumiini-lääkeaineen vaikutusta aggregaattien muodostumisessa. Lopuksi menetelmän toimivuutta tutkittiin absorbanssimittausten ja Western blot -analyysin avulla.

Menetelmän dynaamiseksi mittausalueeksi arvioitiin 25-700 µg/l aggregoitumattomalle β-amyloidipeptidille. Mitattaessa vedessä ja dimetyylisulfoksidissa inkuboituja β-amyloidinäytteitä inkubaatioajan funktiona, energiansiirtosignaali ei kasvanut tai kasvoi hitaasti, mikä tarkoittaisi β-amyloidien säilymistä monomeereina ainakin lyhyitä aikoja. Muissa olosuhteissa β-amyloidit aggregoituivat voimakkaammin. Partikkeliperusteisen menetelmän tulosten mukaan kurkumiinilla ei voitu osoittaa olevan vaikutusta β-amyloidiaggregaattien muodostumiseen.

The purpose of the thesis project was to develop a method for the detection of β-amyloid aggregation. The work was performed in the Institute of Biomedicine at the University of Turku. It was part of a project in which a nonspecific method based on nanoparticles was developed for the study of Alzheimer´s disease.

The method was based on the detection of fluorescence resonance energy transfer by time-resolved fluorometry. In the assay, Alexa Fluor 680 dye-labeled gamma globulins competed with β-amyloids or β-amyloid aggregates for adsorption on to the surface of the Eu(III) nanoparticles. The detected signal varied in proportion to the amount of adsorbed labeled protein on the surface.

In this thesis project optimal measurement conditions were striven for while studying how the different conditions affected the β-amyloid aggregation and how, the effect was reflected in the measured signal. In addition, the effect of incubation time on the aggregation of β-amyloid was investigated. Dimethyl sulfoxide, Ham´s F-12 medium, phosphate buffered saline, 10 mM hydrochloric acid, a salt solution (10 mM HCl, 150 mM NaCl) and water were used as diluents. Furthermore, the effect of a drug, curcumin, was also studied. Finally, absorbance measurements and Western blotting analysis were performed to verify the performance of the method.

The dynamic range of the method was estimated to be 25-700 µg/l for unaggregated β-amyloid. When the β-amyloid samples incubated in water and dimethyl sulfoxide were measured as a function of the incubation time, the energy transfer signal did not increase, or it increased slowly. This suggested that the β-amyloid remained in a monomeric form at least for short periods. In other conditions, β-amyloid aggregated faster. According to the results obtained by the particle-based method, curcumin could not be shown to affect the formation of β-amyloid aggregates.