Proteiinin isoelektrisen pisteen määritysmenetelmän kehittäminen

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Turun yliopiston Biofysiikan laboratoriossa, biolääketieteen laitoksella. Opinnäytetyö oli osa projektia, jossa tutkimusalueena oli nanopartikkeliperusteisten epäspesifisten menetelmien kehittäminen proteiinin ominaisuuksien ja pitoisuuden määrittämiseen käyttäen aikaerotteista fluoresenssia. Työ vaatii määritysten parametrien optimoinnin sekä määrityksen tutkimista ja kehittämistä.

Työn tarkoituksena oli kehittää sekoita ja mittaa -tyyppinen menetelmä proteiinin isoelektrisen pisteen määrittämiseen. Optimoitiin menetelmää, jossa mikrotiitterilevyllä on valmiiksi kuivattuna adsorptiopuskurin komponentit eri pH:iden saavuttamiseksi. Käyttäjä voi siten lisätä vain proteiinin, nanopartikkelit ja dissosiaatiopuskurin. Tästä määritysmenetelmästä pyritään kehittämään nopeampi, edullisempi ja käyttäjäystävällisempi kuin olemassa olevat menetelmät.

Kehitetty mittausmenetelmä perustuu proteiinien erilaiseen adsorboitumiseen Eu(III)-kelaatilla leimattuihin polystyreenipartikkeleihin adsorptiopuskurin pH:sta riippuen. Proteiinien adsorboitumista mitattiin fluoresenssisignaalina, joka on korkeimmillaan proteiinin isoelektrisessä pisteessä ja sitä matalammissa pH:issa.

Menetelmää optimoitaessa löydettiin mittaukselle sopivat parametrit, joiden avulla pystyttiin määrittämään proteiinin isoelektrinen piste suunnilleen puolen pH -yksikön tarkkuudella. Optimoiduiksi parametreiksi saatiin: adsorptiopuskurina universaalipuskuri eri pH:issa ja puskurikomponentit kaivoissa, proteiinipitoisuus 0,21 mg/l ja tilavuus mikrotiitterilevyn kaivossa 70 µl, Eu(III)-partikkelien pitoisuutena 1,7*106/µl tilavuudessa 5 µl, dissosiaatiopuskurina 0,50 M glysiini (pH = 0,75) tilavuudessa 10 µl sekä mittausajankohtana noin 30 minuuttia dissosiaatiopuskurin lisäyksestä.

The thesis project was performed in the Laboratory of Biophysics, Institute of Biomedicine, University of Turku. The thesis was part of a project, in which nanoparticle-based non-specific methods were developed to determine the characteristics and concentration of proteins with the aid of time-resolved fluorescence. The aims of project included the optimization of the determination parameters and further study and development of the method.

The objective was to develop a mix and measure method for the determination of isoelectric points of proteins. The method was optimized as a simple microtiter plate assay, in which the adsorption buffer components are dried to the wells to achieve different pH values, and the end-user needs to add only proteins, nanoparticles and dissociation buffer. The study set out to develop a faster, cheaper and more user-friendly analytical method than the ones currently in use.

The developed method is based on the different adsorption of proteins on polystyrene particles labeled with Eu(III)chelate. The efficiency of adsorption depends on the pH of the adsorption buffer. Protein adsorption was measured in the form of a fluorescence signal which achieves its highest level at the isoelectric point of the protein and below.

In the optimization of the method, suitable parameters were found for the assay in order to determine the isoelectric point of the protein at a precision of approximately 0.5 pH units. The optimized parameters comprised universal buffer as adsorption buffer at different pH levels with buffer components in wells, a protein concentration of 0.21 mg/l and a volume of 70 μl in the microtiter plate well, a concentration of 1.7*106/µl of Eu(III)particles and a volume of 5 µl in the well, 0.50 M glycine (pH 0.75) as the dissociation buffer and a volume of 10 µl in the well, and an incubation time of 30 minutes after the addition of the dissociation buffer.