Perinnöllinen hemokromatoosi, HFE-geenin C282Y- ja H63D -mutaatioiden osoitusmenetelmän koekäyttö, optimointi ja työohjeen laadinta
Hannus, Paavo; Tasso, Juha (2011)
Hannus, Paavo
Tasso, Juha
Tampereen ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011111514562
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011111514562
Tiivistelmä
Perinnöllinen hemokromatoosi on autosomissa periytyvä raudan imeytymishäiriö, jossa elimistöön kertyy ylimääräistä rautaa. Se aiheutuu yleisimmin HFE-geenissä tapahtuvista C282Y- ja H63D -mutaatioista, joissa emäsmuutokset tapahtuvat nukleotideissä 845 ja 187. Emäsmuutos nukleotidissä 845 (G845A) aiheuttaa kysteiinin korvautumisen tyrosiinilla aminohappopaikassa 282 ja emäsmuutos nukleotidissa 187 (C187G) aiheuttaa histidiinin korvautumisen asparagiinihapolla paikassa 63. Hemokromatoosia aiheuttavat mutaatiot osoitetaan usein polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvilla menetelmillä, joissa tiettyä osaa geenistä monistetaan tunnettujen alukkeiden ja DNA:ta monistavan polymeraasientsyymin avulla. PCR-tuotteiden ja niihin lisättyjen restriktioentsyymien seosta inkuboidaan entsyymien vaatimissa lämpötiloissa. Mutaatiot aiheuttavat DNA:ssa restriktioentyymien tunnistuskohtien häviämistä tai niiden lisääntymistä. Restriktioentsyymien pilkkomat DNA-jaksot saadaan esille agaroosigeelielektroforeesilla.
Opinnäytetyö tehtiin Tampereen ammattikorkeakoululle, jossa sen tuotoksena valmistunutta työohjetta voidaan käyttää bioanalytiikan ja laboratorioalan koulutusohjelmien harjoitustöissä ja syventävillä opintojaksoilla. Opinnäytetyön tarkoituksena oli koekäyttää hemokromatoosia aiheuttavien mutaatioiden osoittamiseen käytettävä kaupallinen työohje, optimoida restriktiofragmenttien pituuspolymorfia-analyysiin perustuva menetelmä sekä laatia toimiva ja selkeä suomenkielinen työohje.
Koekäytön ja menetelmäoptimoinnin aikana havaitut alkuperäisen työohjeen epäjohdonmukaisuudet korjattiin ja menetelmä saatiin toimimaan toivotulla tavalla. Samalla menetelmään tehtiin muutoksia, jotka tuovat säästöjä reagenssikuluihin. Tuotoksena valmistui työohje, jonka avulla opiskelijat pystyvät itsenäisesti suorittamaan menetelmän eri vaiheet. Jatkotutkimuksena menetelmää voisi kehittää edelleen korvaamalla polymeraasientsyymin edullisemmalla vaihtoehdolla ja optimoimalla sille polymeraasiketjureaktio-ohjelma. Samalla menetelmän digestiovaiheessa voisi kokeilla lyhyempiä digestioaikoja.
Opinnäytetyö tehtiin Tampereen ammattikorkeakoululle, jossa sen tuotoksena valmistunutta työohjetta voidaan käyttää bioanalytiikan ja laboratorioalan koulutusohjelmien harjoitustöissä ja syventävillä opintojaksoilla. Opinnäytetyön tarkoituksena oli koekäyttää hemokromatoosia aiheuttavien mutaatioiden osoittamiseen käytettävä kaupallinen työohje, optimoida restriktiofragmenttien pituuspolymorfia-analyysiin perustuva menetelmä sekä laatia toimiva ja selkeä suomenkielinen työohje.
Koekäytön ja menetelmäoptimoinnin aikana havaitut alkuperäisen työohjeen epäjohdonmukaisuudet korjattiin ja menetelmä saatiin toimimaan toivotulla tavalla. Samalla menetelmään tehtiin muutoksia, jotka tuovat säästöjä reagenssikuluihin. Tuotoksena valmistui työohje, jonka avulla opiskelijat pystyvät itsenäisesti suorittamaan menetelmän eri vaiheet. Jatkotutkimuksena menetelmää voisi kehittää edelleen korvaamalla polymeraasientsyymin edullisemmalla vaihtoehdolla ja optimoimalla sille polymeraasiketjureaktio-ohjelma. Samalla menetelmän digestiovaiheessa voisi kokeilla lyhyempiä digestioaikoja.