Coxsackievirus A9 -infektio RD- ja A549-soluissa : viruksen muuntuminen ja RGD-alueen rooli infektiossa

Abstract

Tämän opinnäytetyön tavoitteena on tarkastella RGD-alueen merkitystä pikornavirus CAV9:ssä. Coxsackievirus A9 on pieni, yksisäikeinen RNA-virus, jonka genomia ympäröi proteiinikuori, joka koostuu yhteensä kuudestakymmenestä VP1-, VP2-, VP3- ja VP4–proteiinialayksiköstä. CAV9:n pintarakenteen VP1-proteiinissa sijaitseva RGD-alue on kolmen aminohapon muodostama ketju, jonka avulla virus oletettavasti sitoutuu solupinnan αV-integriineihin. Geneettisesti muokattu virus, CAV9-RGDdel, josta RGD-alue puuttuu, ei sitoudu αV-integriineihin in vitro, eikä siten infektoi mm. ihmisen keuhkoepiteelisoluja (A549), mutta kykenee silti infektoimaan mm. RD-soluja ilman integriini-välitteistä sitoutumista. RNA-viruksille on tyypillistä, että ne muuntuvat pistemutaatioiden kautta nopeasti, ja tämä muuntumiskyky mahdollistaa viruspopulaation säilymisen eri olosuhteissa. Infektion aikaansaanut virus luo uuden populaation, minkä takia virus pitää määritellä virusjoukkona, jossa kullakin viruksella on hiukan toisistaan poikkeavat genomit. RNA-polymeraasi on luonnostaan sopivan epätarkka syntetisoidessaan uusia genomeja. Tästä syystä tarkastelun kohteeksi on valittu myös virusgenomin ei-rakenteellinen alue 3D, jossa sijaitsee RNA-polymeraasia koodaava geenialue. Opinnäytetyössä tarkasteltiin sekä CAV9- että CAV9-RGDdel-virusten lisääntymistä A549- ja RD-soluissa. Tutkimuksessa havaittiin hieman yllättäen, että CAV9-RGDdel infektoi A549-soluja ja alkoi lisääntyä pasasoinnin edetessä yhä nopeammin. Infektionopeuden lisääntymistä havainnoitiin mm. tarkastelemalla sekvenssitason muutoksia VP1- ja 3D-alueissa ja kuvantamalla virusinfektiota soluviljelmissä. Tämän lisäksi tehtiin ns. integriini-sitoutumiskoe. Työ suoritettiin Turun yliopistolla, Virusopilla, ja tutkimusmenetelminä käytettiin mm. soluviljelyä, virus-RNA:n eristystä, RT-PCR:ää, AGEa ja immunosytokemiaa. Lähes kaikki kerätyt näytteet saatiin valmiiksi sekvensointia varten, mutta sekvensointia ei aikataulullisista syistä ehditty tehdä. In vitro integriini-sitoutumiskokeella osoitettiin, että CAV9-RGDdel-virus oli säilynyt RGD-alueen suhteen ennallaan. Alustavissa kuvantamiskokeissa havaittiin, että infektiivisyys on varhaisissa pasaaseissa matalampi kuin myöhäisemmissä pasaaseissa.

The purpose of this thesis was to study the role of the RGD motif in the picornavirus CAV9. Coxsackievirus A9 is a small, single-stranded RNA virus whose genome is surrounded by a protein capsid consisting of sixty VP1, VP2, VP3, and VP4 protein units. The VP1 surface protein of CAV9 contains the RGD motif, a chain of three amino acids, which the virus supposedly uses to bind to the extracellular domain of αV integrins. The genetically modified strain of CAV9, CAV9-RGDdel, lacks the RGD motif and cannot bind to αV integrins in vitro but is still able to infect some human cell lines, such as RD cells without integrin-mediated binding. RNA viruses typically transform through frequently occurring point mutations, due to which it is possible for a viral population to survive in various conditions. Because each infecting virus creates a new viral population, viruses must be defined as viral groups, in which every virus has a slightly differing genome. RNA polymerase is inherently inaccurate and creates divergent copies of the viral genome. For this reason it was also chosen to study the non-structural 3D area of the virus genome, which contains the RNA polymerase gene. The main goal of this bachelor’s thesis was to study the growth of CAV9 and CAV9-RGDdel viruses in A549 and RD cells. Surprisingly, our research revealed that CAV9-RGDdel infected A549 cells and began to proliferate faster when passaged. The speed of infection rate was demonstrated by examining changes in the VP1 and 3D sequences and by imaging viral infections in cell cultures. Additionally, an integrin binding test was performed. This thesis was carried out in the Department of Virology at the University of Turku. The research methods included, among others, viral isolation, RT-PCR, AGE, and immunocytochemistry. Almost all samples were prepared for sequencing but due to limited time the sequencing could not be performed. The Integring binding test indicated that the RGD motif of the CAV9-RGDdel virus remained the same. In the preliminary imaging tests it was discerned that infecticity is lower in the earlier passages than in the later passages.