Uusien steroideja sitovien avidiinimutanttien tuotto ja karakterisointi

Abstract

Homotetrameerinen avidiini-proteiini tunnetaan sen huomattavan korkeasta affiniteetista ligandiinsa biotiiniin. Korkean affiniteetin lisäksi avidiini on proteiinina poikkeuksellisen kestävä ulkoisia voimia vastaan. Ensiluokkainen kestävyys ja korkea affiniteetti ligandia kohtaan tekevät avidiinista mielenkiintoisen tutkimuskohteen eri sovelluksiin. Avidiinin ligandinsitomista on tutkittu runsaasti ja proteiinia on muokattu niin kemiallisesti kuin geneettisestikin. Muokkaamalla avidiinin ligandinsitomispaikkaa on saatu aikaan steroideja sitovia avidiinimutantteja, joiden affiniteetti biotiinille on vähentynyt.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia kahdelle uudelle steroideja sitoville avidiinimutanteille tehtyjen pistemutaatioiden vaikutusta proteiinin tuottoon, lämpöstabiiliuteen ja ligandin sitomisaffiniteettiin. Pistemutaatiot olivat muutos isoleusiinista tyrosiiniksi kohdassa 117 (I117Y) tai asparagiinista asparagiinihapoksi kohdassa 118 (N118D). Proteiinit tuotettiin pullokasvatuksina Escherichia coli -solujen periplasmiseen tilaan ja puhdistettiin affiniteettikromatografisesti nikkeli-sefaroosi-matriisilla ja puhtautta arvioitiin geelielektroforeesilla. Proteiinien aktiivisuutta ja stabiilisuutta karakterisoitiin geelisuodatuksen avulla ja kalorimetrisin kokein niin differentiaalisella pyyhkäisykalorimetrialla kuin isotermisellä titrauskalorimetriallakin.

Pistemutatoituja avidiinimutantteja saatiin tuotettua liukoisena ja aktiivisessa tetrameerisessä muodossaan. Proteiinit ekspressoituivat erittäin hyvin. N118- pistemutantin havaittiin suosivan testosteronin sitoutumista verrattuna progesteroniin, mutta sen lämpöstabiliteetti oli alentunut. I117Y-pistemutantin tuotto oli selkeästi N118D-pistemutanttia parempaa. I117Y-pistemutaation vaikutus proteiinin lämpöstabiiliuteen oli huomattava. Ligandinsitomisaffiniteetteja ei onnistuttu luotettavasti määrittämään titrauskalorimetrialla, mutta affiniteetti biotiinia kohtaan näytti selvästi heikenneen kaikilla proteiinimutanteilla.

Uusista pistemutaatioista avidiinin steroideja sitoviin mutantteihin saatiin paljon hyödyllistä tietoa proteiinien toiminnan kannalta. Tulevaisuudessa voitaisiin selvittää molempien pistemutaatioiden toiminta yhdessä. Lisäksi affiniteetti eri ligandeja kohtaan tulisi määrittää joko eri olosuhteissa tai eri menetelmällä.

The homotetrameric avidin protein is well-known for its extremely high affinity towards biotin. In addition, the protein exhibits exceptional stability in varying conditions. The protein’s high ligand-binding affinity and stability makes avidin an interesting subject for research. The ligand-binding of avidin has been thoroughly investigated and the protein has been modified chemically and genetically for research purposes. By modifying the ligand-binding site of avidin, novel steroid-binding avidins exhibiting lower biotin-affinity have been manufactured.

The purpose of this Bachelor’s Thesis was to collect information on the effects of the introduced point mutations from isoleucine to tyrosine at location 117(I117Y) and from asparagine to aspartic acid at location 118 (N118D) to the ligand-binding affinity, thermal stability and the production of two novel steroidbinding avidin mutants. The proteins were expressed to the periplasmic space of Escherichia coli cells and produced as batch cultures in Erlenmeyer flasks. Purification was carried out by affinity chromatography using a nickel sepharose matrix and the overall purity of the proteins was assayed with gel electrophoresis. The measurements for protein activity and stability were conducted using gel filtration and calorimetry. The calorimetric tools used were: differential scanning calorimetry and isothermal titration calorimetry.

The study indicated it was possible to produce the point-mutated avidins both in soluble and active tetrameric form. The quantity of the expressed protein exceeded the needs for the thesis work. The results indicated the N118D-mutant favored the binding of testosterone over progesterone but its thermal stability had decreased. According to expectations, the I117Y-mutant showed increased thermal stability and the overall yield of the protein was greater than that of the N118D-mutant. Isothermal titration calorimetry failed to produce reliable binding affinities to all the protein ligand combinations but suggested lower binding affinity towards biotin.

The information gathered through this Bachelor’s Thesis proved highly valuable in understanding the functions of the novel steroid-binding avidins. For future research, co-operation of both the mutations studied could be assayed. The affinity towards the different ligands could be achieved using different methods or changing the measurement conditions.