Virusproteiinien tuotto hyönteissoluissa bakuloviruksen avulla

Abstract

Työn tarkoituksena oli tuottaa bakuloviruksen avulla tiettyjä pikornavirusproteiineja hyönteissoluissa. Menetelmässä käytettiin Bac-to-Bac-kitin sisältämää FastBac™-vektoria, jota käyttäen pintaproteiineja koodaava DNA-jakso siirtyy DHc10Bac E. coli -soluissa olevaan bacmidiin. Bacmidi on muokattu bakuloviruksesta, ja kun se transfektoidaan hyönteissoluihin, bacmidiin kloonatut pikornavirusproteiinit alkavat ekspressoitua.

Työssä kloonattiin neljän eri pikornaviruksen VP1-proteiinia koodaavaa geeniä. Nämä olivat peräisin CAV9- ja CBV3-enteroviruksista ja HPEV1- ja HPEV3-parechoviruksista. CAV9-, CBV3- ja HPEV1-VP1-proteiineja koodaavat geenit monistettiin plasmideista. HPEV3-VP1-proteiinia koodittava geeni (virus-RNA) eristettiin suoraan potilasnäytteestä RT-PCR:n avulla. VP1-geenit (insertit) kloonattiin TA-vektoriin, tuotettiin E. coli -soluissa ja siirrettiin TA-vektorista restriktioentsyymi-leikkausta ja ligaatiota käyttämällä FastBac™-vektoriin. Yhdistelmävektori transfektoitiin kompetentteihin DHcBac10 E. coli -soluihin, joissa insertti siirtyi bacmidiin.

Työssäni tuotettavia pikornavirusproteiineja on suunniteltu käytettäväksi serologisissa tutkimuksissa vasta-ainesitojina, immunogeeneinä vasta-aineiden tuotossa ja antigeeneina erilaisissa in vitro –kokeissa, joissa tutkitaan proteiinien sitoutumista solutekijöihin.

The purpose of this study was to produce picornaviral proteins by means of recombinant baculoviruses. The Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System is a method for the generation of recombinant baculoviruses. The method is based on site-spesific transposition of genes to be expressed into a baculovirus vector (bacmid). The bacmid is a modified shuttle vector, which allows picornaviral gene expression in insect cells.

Four picornaviral capsid VP1 proteins were used in the study. They derived from enteroviruses (CAV9 and CBV3) and parechoviruses (HPEV1 and HPEV3). Genes encoding VP1 proteins from CAV9, CBV3 and HPEV1 were encoded from plasmids. The gene (viral RNA) encoding the HPEV3-VP1 protein was isolated from patient samples by RT-PCR. The VP1 genes were cloned into TA vector to produce them in E. coli cells and inserts were transferred into FastBac™ vectors using restriction enzyme-mediated digestion and ligation. The inserts were transfected from the recombinant FastBac™ vector to the bacmid. Isolated recombinant bacmid was transfected into insect cells.

Picornaviral VP1-proteins will be useful in serological studies, as immunogens in antibody generation, and as binders in antigen binding studies.