EphA3-reseptoriproteiinin ligandia sitovan osan tuotto eri isäntäorganismeissa sekä puhdistus ja karakterisointi

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin osa Joint Biotechnology Laboratory:n Eph-reseptoriproteiinien ja efriiniligandien tutkimusprojektia. Opinnäytetyön tavoitteena oli tuottaa EphA3 reseptoriproteiinin ligandia sitovaa osaa kahdessa eri isäntäorganismissa Escherichia colissa ja Pichia pastoriksessa sekä puhdistaa tuotettu proteiini ja karakterisoida sen sitoutumisominaisuuksia eri efriiniligandien kanssa.

Proteiinin tuottamiseksi EhA3LBD:n geeni kloonattiin kahteen ekpressiovektoriin pET32a sekä pPIC9 ja transformoitiin tuottokantoihin (E. coli Origami B, P. pastoris GS115). Proteiinin puhdistus tehtiin talliaffiniteettikromatografian avulla. Eri työvaiheiden tuloksia analysoitiin agaroosielektroforeesin ja SDS-PAGE menetelmien avulla.

Geenin kloonaus ja transformointi molempiin tuottokantoihin onnistui, mutta proteiinia tuotetettiin onnistuneesti ainoastaan Escherichia colin avulla. Onnistuneesti puhdistetun proteiinin avulla tutkittiin EphA3LBD sitoutuvuutta efriiniligandien A5, A3 ja B1 kanssa. Sitoutumiskokeen tulokseksi todettiin EphA3LBD reseptoriproteiinin sitoutuvan A3 ja B1 efriiniligandien kanssa.

This thesis is part of a research project by the Joint Biotechnology Laboratory concerning Eph receptor proteins and ephrins. The goal of this thesis was to produce a receptor protein called EphA3LBD (LBD = Ligand Binding Domain) with Escherichia coli and Pichia pastoris and then purify and characterize the protein.

The production of the protein was enabled by cloning the EphA3LBD gene into two plasmids, pPET32a and pPIC9, and transforming the plasmids into Escherichia coli and Pichia pastoris. The purification was performed by immobilized metal ion affinity chromatography using Ni Sepharose. The different stages and final results of the thesis were analysed by agarose electrophoresis and SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis).

The EphA3LBD gene was successfully transformed into E. coli and P. pastoris but successfully produced only with E. coli. The produced protein EphA3LBD was purified and used for determination of the binding ephrin ligands A5, A3 and B1. By Pull-Down analysis it was shown that the EphA3LBD receptor protein binds ephrin ligands A3 and B1.