FNR-isoentsyymien ylituotto lituruohon kloroplastissa
Bilal, Ilaf (2012)
Bilal, Ilaf
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201205097280
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201205097280
Tiivistelmä
Arabidopsis thaliana, lituruoho, toimii kasvikunnan malliorganismina muun muassa forosynteesireaktioiden tutkimisessa. Fotosynteesireaktioissa vihreät kasvit tuottavat kloroplasteissaan vedestä ja hiilidioksidista auringon energian avulla happea ja sokeria. FNR (Ferredoksiini-NADP+-oksidoreduktaasi-entsyymi) osallistuu fotosynteesissä elektronin-siirtoreaktioihin pelkistämällä NADP+:n NADPH-molekyyliksi, jota käytetään ATP:n kanssa hiilensidontareaktioissa.
Lituruohon genomissa kaksi eri geeniä At5g66190 (FNR1) ja At1g20020 (FNR2) koodaavat kloroplastiin ohjautuvia FNR-isoentsyymejä. Molempia isoentsyymejä esiintyy villityypin kasveilla kloroplastissa sekä liukoisessa muodossa että kiinnittyneinä tylakoidikalvoon. fnr1-poistogeenisellä kasveilla FNR1-geeni on keskeytetty, jonka seurauksena FNR1-proteiinia ei tuoteta mutta FNR2-proteiinia esiintyy kloroplastin stroomassa. fnr2-poistogeeniset kasvit eivät tuota FNR2-proteiinia mutta FNR1-proteiinia esiintyy kloroplastin stroomassa ja tylakoidikalvoilla.
Opinnäytetyön tarkoituksena on valmistaa FNR1 yliekspressiolinja fnr2-poistogeeniseen taustaan ja FNR2 yliekspressiolinja fnr1-poistogeeniseen taustaan. Yliekspressiolinjoissa tuotetaan ylimäärin kyseistä FNR-isoentsyymiä. Yliekspressiolinjoja tutkimalla pyritään selvittämään johtuuko mutanttikasvien fenotyyppi FNR:n alhaisesta totaalimäärästä vai ainoastaan toisen isoentsyymin puuttumisesta. Samalla kerätään lisätietoa fotosynteesi-mekanismeista.
Yliekspressiolinjoja tuotetaan käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikan menetelmiä. E. colin DH10B-linjan DKLAT5g66190- ja DKLAT1g20020-plasmideissa olevat FNR-geenit eristetään ja liitetään agrobakteerissa toimivaan pGWR8-plasmidiin. pGWR8-konstruktit transformoidaan agrobakteeriin, joka luonnostaan pystyy infektoimaan kasveja Ti-plasmidinsa avulla. Infektoituneet kasvit voidaan erottaa muista kasveista pGWR8-plasmidissa olevan antibioottiresistenssikasetin avulla kasvattamalla kasvin siemeniä selektiivisellä kasvatusalustalla. Vain mutatoituneet siemenet voivat kasvattaa alustalla juuria ja ne voidaan siten siirtää mullalle kasvamaan. Agrobakteerivälitteisen trasformaation tuloksena saadaan kaksi mutanttikasvia, yksi tuottaa ylimäärin FNR1- isoentsyymiä ja toinen FNR2-isoentsyymiä. Homotsygoottisia kasveja tutkitaan myöhemmin muun muassa proteiinitasolla immunoblottauksella.
Lituruohon genomissa kaksi eri geeniä At5g66190 (FNR1) ja At1g20020 (FNR2) koodaavat kloroplastiin ohjautuvia FNR-isoentsyymejä. Molempia isoentsyymejä esiintyy villityypin kasveilla kloroplastissa sekä liukoisessa muodossa että kiinnittyneinä tylakoidikalvoon. fnr1-poistogeenisellä kasveilla FNR1-geeni on keskeytetty, jonka seurauksena FNR1-proteiinia ei tuoteta mutta FNR2-proteiinia esiintyy kloroplastin stroomassa. fnr2-poistogeeniset kasvit eivät tuota FNR2-proteiinia mutta FNR1-proteiinia esiintyy kloroplastin stroomassa ja tylakoidikalvoilla.
Opinnäytetyön tarkoituksena on valmistaa FNR1 yliekspressiolinja fnr2-poistogeeniseen taustaan ja FNR2 yliekspressiolinja fnr1-poistogeeniseen taustaan. Yliekspressiolinjoissa tuotetaan ylimäärin kyseistä FNR-isoentsyymiä. Yliekspressiolinjoja tutkimalla pyritään selvittämään johtuuko mutanttikasvien fenotyyppi FNR:n alhaisesta totaalimäärästä vai ainoastaan toisen isoentsyymin puuttumisesta. Samalla kerätään lisätietoa fotosynteesi-mekanismeista.
Yliekspressiolinjoja tuotetaan käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikan menetelmiä. E. colin DH10B-linjan DKLAT5g66190- ja DKLAT1g20020-plasmideissa olevat FNR-geenit eristetään ja liitetään agrobakteerissa toimivaan pGWR8-plasmidiin. pGWR8-konstruktit transformoidaan agrobakteeriin, joka luonnostaan pystyy infektoimaan kasveja Ti-plasmidinsa avulla. Infektoituneet kasvit voidaan erottaa muista kasveista pGWR8-plasmidissa olevan antibioottiresistenssikasetin avulla kasvattamalla kasvin siemeniä selektiivisellä kasvatusalustalla. Vain mutatoituneet siemenet voivat kasvattaa alustalla juuria ja ne voidaan siten siirtää mullalle kasvamaan. Agrobakteerivälitteisen trasformaation tuloksena saadaan kaksi mutanttikasvia, yksi tuottaa ylimäärin FNR1- isoentsyymiä ja toinen FNR2-isoentsyymiä. Homotsygoottisia kasveja tutkitaan myöhemmin muun muassa proteiinitasolla immunoblottauksella.