Coxsackievirus A9-näytteiden VP1- ja 3D-geenien RT-PCR-reaktiot ja PCR-tuotteiden sekvensointi
Lukkaroinen, Sarianne (2012)
Lukkaroinen, Sarianne
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012061112402
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012061112402
Tiivistelmä
Työn tarkoituksena oli kehittää menetelmä ja tuottaa CAV9-näytteiden VP1- ja 3Dpol-geenialueista PCR-tuotteet ja määrittää niitä vastaavat sekvenssit. VP1- ja 3D-geenien sekvenssejä vertaillaan silloin, kun halutaan verrata virusten muuntumista. VP1-geeni tuottaa rakenneproteiinia, jonka avulla virus sitoutuu solun pintaan, reseptoriin. 3D-geeni taas tuottaa entsyymiä, joka monistaa genomia. Tässä opinnäytetyössä selvitettiin myös vaikuttaako PCR-tuotteen puhdistustapa sekvensointitulokseen. Lisäksi tutkittiin CAV9-viruksen adaptaatiota keuhkosyöpäsolulinjaan mm. PCR:n ja immunofluoresenssin avulla.
Tässä työssä tutkittavana oleva Coxsackievirus A9 (CAV9) kuuluu ihmisen enterovirus (HEV) B-lajiin. Enterovirukset taas kuuluvat enterovirus-sukuun ja pikornavirus-perheeseen. Pikornavirus-perheeseen kuuluu 12 sukua, joista yleisimpiä ihmisen taudinaiheuttajia ovat entero-, rino-, hepato- ja parechovirukset. Pikornavirukset ovat pieniä pallomaisia ja vaipattomia RNA-viruksia. CAV9 on yleinen ihmispatogeeni, joka aiheuttaa hengitystieinfektioita, sydänlihastulehduksia ja keskushermostoinfektioita. CAV9:llä on VP1-proteiinissa arginiini-, glysiini- ja aspartaatti-aminohappojen muodostama RGD-motiivi, jonka avulla se sitoutuu solun pinnan reseptoreihin.
Työn suoritus aloitettiin eristämällä viruksista RNA. RNA:sta tehtiin cDNA RT-reaktiossa antisense-alukkeilla. RT-reaktiosta saatua cDNA:ta käytettiin templaattina PCR:ssä. PCR-tuotteet puhdistettiin, jonka jälkeen ne ajettiin agaroosigeelille. Puhdistetut DNA-näytteet lähetettiin sekvensoitavaksi. Sekvenssit analysoitiin silmämääräisesti. Tämän lisäksi tehtiin infektion kuvantaminen pasasointinäytteistä immunofluoresenssimikroskoopilla. Tässä työssä käsiteltiin kahta eri näytesarjaa, rekombinaatio- ja pasasointisarjaa.
Rekombinaatiosarjassa saatiin 56 sekvenssiä. Pasasointisarjassa saatiin yhteensä 66 sekvenssiä. Näytteiden puhdistuksessa ei ollut juuri mitään eroa, joten kaikkia menetelmiä voi käyttää PCR-tuotteen puhdistamiseen. Rekombinaatiosarjassa saatiin tarvittava määrä sekvenssejä, jotta niitä voidaan tulevaisuudessa vertailla. Pasasointisarjassa saatiin reilusti yli puolelle näytteistä kunnollinen sekvenssi. A549-soluja infektoitiin pasasointisarjan viruksilla. Immunofluoresenssimikroskoopin avulla nähtiin, että virukset ovat muuntuneet, mutta ne ovat sopeutuneet uusiin olosuhteisiin.
Tässä työssä tutkittavana oleva Coxsackievirus A9 (CAV9) kuuluu ihmisen enterovirus (HEV) B-lajiin. Enterovirukset taas kuuluvat enterovirus-sukuun ja pikornavirus-perheeseen. Pikornavirus-perheeseen kuuluu 12 sukua, joista yleisimpiä ihmisen taudinaiheuttajia ovat entero-, rino-, hepato- ja parechovirukset. Pikornavirukset ovat pieniä pallomaisia ja vaipattomia RNA-viruksia. CAV9 on yleinen ihmispatogeeni, joka aiheuttaa hengitystieinfektioita, sydänlihastulehduksia ja keskushermostoinfektioita. CAV9:llä on VP1-proteiinissa arginiini-, glysiini- ja aspartaatti-aminohappojen muodostama RGD-motiivi, jonka avulla se sitoutuu solun pinnan reseptoreihin.
Työn suoritus aloitettiin eristämällä viruksista RNA. RNA:sta tehtiin cDNA RT-reaktiossa antisense-alukkeilla. RT-reaktiosta saatua cDNA:ta käytettiin templaattina PCR:ssä. PCR-tuotteet puhdistettiin, jonka jälkeen ne ajettiin agaroosigeelille. Puhdistetut DNA-näytteet lähetettiin sekvensoitavaksi. Sekvenssit analysoitiin silmämääräisesti. Tämän lisäksi tehtiin infektion kuvantaminen pasasointinäytteistä immunofluoresenssimikroskoopilla. Tässä työssä käsiteltiin kahta eri näytesarjaa, rekombinaatio- ja pasasointisarjaa.
Rekombinaatiosarjassa saatiin 56 sekvenssiä. Pasasointisarjassa saatiin yhteensä 66 sekvenssiä. Näytteiden puhdistuksessa ei ollut juuri mitään eroa, joten kaikkia menetelmiä voi käyttää PCR-tuotteen puhdistamiseen. Rekombinaatiosarjassa saatiin tarvittava määrä sekvenssejä, jotta niitä voidaan tulevaisuudessa vertailla. Pasasointisarjassa saatiin reilusti yli puolelle näytteistä kunnollinen sekvenssi. A549-soluja infektoitiin pasasointisarjan viruksilla. Immunofluoresenssimikroskoopin avulla nähtiin, että virukset ovat muuntuneet, mutta ne ovat sopeutuneet uusiin olosuhteisiin.