Coxsackievirus A9-näytteiden VP1- ja 3D-geenien RT-PCR-reaktiot ja PCR-tuotteiden sekvensointi

Abstract

Työn tarkoituksena oli kehittää menetelmä ja tuottaa CAV9-näytteiden VP1- ja 3Dpol-geenialueista PCR-tuotteet ja määrittää niitä vastaavat sekvenssit. VP1- ja 3D-geenien sekvenssejä vertaillaan silloin, kun halutaan verrata virusten muuntumista. VP1-geeni tuottaa rakenneproteiinia, jonka avulla virus sitoutuu solun pintaan, reseptoriin. 3D-geeni taas tuottaa entsyymiä, joka monistaa genomia. Tässä opinnäytetyössä selvitettiin myös vaikuttaako PCR-tuotteen puhdistustapa sekvensointitulokseen. Lisäksi tutkittiin CAV9-viruksen adaptaatiota keuhkosyöpäsolulinjaan mm. PCR:n ja immunofluoresenssin avulla. Tässä työssä tutkittavana oleva Coxsackievirus A9 (CAV9) kuuluu ihmisen enterovirus (HEV) B-lajiin. Enterovirukset taas kuuluvat enterovirus-sukuun ja pikornavirus-perheeseen. Pikornavirus-perheeseen kuuluu 12 sukua, joista yleisimpiä ihmisen taudinaiheuttajia ovat entero-, rino-, hepato- ja parechovirukset. Pikornavirukset ovat pieniä pallomaisia ja vaipattomia RNA-viruksia. CAV9 on yleinen ihmispatogeeni, joka aiheuttaa hengitystieinfektioita, sydänlihastulehduksia ja keskushermostoinfektioita. CAV9:llä on VP1-proteiinissa arginiini-, glysiini- ja aspartaatti-aminohappojen muodostama RGD-motiivi, jonka avulla se sitoutuu solun pinnan reseptoreihin. Työn suoritus aloitettiin eristämällä viruksista RNA. RNA:sta tehtiin cDNA RT-reaktiossa antisense-alukkeilla. RT-reaktiosta saatua cDNA:ta käytettiin templaattina PCR:ssä. PCR-tuotteet puhdistettiin, jonka jälkeen ne ajettiin agaroosigeelille. Puhdistetut DNA-näytteet lähetettiin sekvensoitavaksi. Sekvenssit analysoitiin silmämääräisesti. Tämän lisäksi tehtiin infektion kuvantaminen pasasointinäytteistä immunofluoresenssimikroskoopilla. Tässä työssä käsiteltiin kahta eri näytesarjaa, rekombinaatio- ja pasasointisarjaa. Rekombinaatiosarjassa saatiin 56 sekvenssiä. Pasasointisarjassa saatiin yhteensä 66 sekvenssiä. Näytteiden puhdistuksessa ei ollut juuri mitään eroa, joten kaikkia menetelmiä voi käyttää PCR-tuotteen puhdistamiseen. Rekombinaatiosarjassa saatiin tarvittava määrä sekvenssejä, jotta niitä voidaan tulevaisuudessa vertailla. Pasasointisarjassa saatiin reilusti yli puolelle näytteistä kunnollinen sekvenssi. A549-soluja infektoitiin pasasointisarjan viruksilla. Immunofluoresenssimikroskoopin avulla nähtiin, että virukset ovat muuntuneet, mutta ne ovat sopeutuneet uusiin olosuhteisiin.

The purpose of the thesis was to develop the method and to produce the PCR products of the VP1 and 3D gene regions of the CAV9 samples and to determine the corresponding sequences. The sequences of the VP1 and 3D genes are compared when a comparison of virus transformation is desired. The VP1 gene produces the structural protein with the help of which the virus binds itself to the cell surface, the receptor. The 3D gene, then produces the enzyme which duplicates the genome. In this thesis it also was clarified if the purification of the PCR product affects the sequencing result. Furthermore, the adaptation of the CAV9 virus to a lung cancer cell line was studied, among other means, with the help of PCR and immunofluorescence. The coxsackievirus A9 (CAV9) studied in this thesis belongs to the species human enterovirus B, (HEV). Enteroviruses in turn belong to the genus Enterovirus and the family Picornaviridae. The family Picornaviridae includes 12 families, the most common human pathogens being enterovirus, rhinovirus, hepatovirus and parechoviruses. Picornaviruses are small spherical and single stranded RNA viruses. CAV9 is a general pathogen which causes respiratory tract infections, myocarditis and central nervous system infections. CAV9 has in the VP1 protein an RGD motive, formed by the arginyl-glycyl-aspartic acid, with the help of which it binds itself to the receptors on the surface of the cell. The stud was begun by isolating RNA from the viruses. RNA was converted into cDNA in an RT reaction with antisense primers. The cDNA that was obtained from the RT reaction was used as a template in the PCR reaction. The PCR products were purified after which they were driven onto agarose gel. The purified DNA samples were sent to be sequenced. The sequences were analyzed visually. In addition to this, the imaging of the infection performed by immunofluorescence microscopy of passage samples. In this thesis two different sample series were dealt with, a recombination and a passage series. In the recombination series 56 sequences were obtained. In the passage series altogether 66 sequences were obtained. There was hardly any difference in the purification of the samples so all the methods can be used for the purification of the PCR product. In the recombination series a sufficient number of sequences was obtained so that they can be compared in the future. In the passage series a decent sequence was obtained for well more than half of the samples. The A549 cells were infected with the viruses from the passage series. With the help of immunofluorescence microscopy it was seen that the viruses had transformed but had adapted themselves to the new conditions.