Hiivavektoreiden muokkaus Golden Gate Shuffling -menetelmää varten

Abstract

Golden Gate Shuffling on tyypin IIs restriktioentsyymeihin perustuva kloonausmenetelmä. Sen tarkoituksena on nopeuttaa moniosaisten inserttien yhdistämistä ja kloonausta geenivektoriin. Tässä työssä oli tarkoitus muokata kahta Pichia pastoriksessa käytettävää plasmidivektoria (pPICZ A ja pGAPZ A; Invitrogen) siten, että niihin voidaan siirtää inserttejä Golden Gate Shuffling -kloonausmenetelmällä. Vektoreista poistettiin ensin kolme BsaI-tunnistuskohtaa. Tämä tapahtui PCR:n ja mutatoitujen koettimien avulla. Tämän jälkeen suunniteltiin ja tehtiin kaksi uutta BsaI-tunnistuskohtaa plasmidien monikloonausalueille. Golden Gate Shuffling -kloonausmenetelmän toimivuus testattiin ja tehtiin tuottotesti Pichia pastoriksessa. Suunnitellut muokkaukset suoritettiin kummallekin vektorille. Shuffling-menetelmän käyttö vaatinee kuitenkin optimointia riippuen käytettävien insertien määrästä. Vastaavanlaisten vektorimuokkausten kannattavuutta tulee harkita tulevaisuudessa DNA-syntetiikan kehittyessä ja tullessa yhä edullisemmaksi. Tällä hetkellä in vitro DNA-synteesillä kyetään jo helposti tuottamaan yli 3 kb:n kappaleita ja tilattuna tämän kokoisen palan hinnaksi tulisi hieman yli 1000 euroa. Hinta on erittäin alhainen tehtyyn työmäärään ja reagenssimäärään nähden.

Golden Gate Shuffling is a cloning strategy based on the function of type IIs restriction enzymes. It was created to facilitate the combination of multiple-part gene inserts and their incorporation into cloning vectors. The purpose of this study was to modify two plasmid vectors (pPICZ A, pGAPZ A; Invitrogen) made for the yeast Pichia pastoris so that gene inserts could be incorporated in them by the cloning method Golden Gate Shuffling. Three recognition sites for the BsaI restriction enzyme were first altered by mutated primers and PCR. Two new recognition sites were introduced to the MCSs of the vectors. Lastly the cloning method was tested with the modified vectors and a protein expression test was performed in Pichia pastoris. The alterations were carried out as planned. The cloning method, Golden Gate Shuffling, needs case-specific optimization depending on the number of gene inserts introduced into the vector. With the increasing affordability of artificial gene synthesis, this type of vector modifications should be considered. Today size 3 kb DNA fragments can easily be produced in vitro and the cost for one 3 kb piece would be a little over 1000 €. The price is low compared to the amount of work and reagents put into the process.