Rasvakudoksen endoteelisolujen eristys ja karakterisointi

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Tampereen yliopiston Aikuisten kantasolut -tutkimusryhmässä, jonka tutkimus keskittyy ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen toimintaa sääteleviin solu- ja molekyylimekanismeihin sekä kantasolujen erilaistumiseen. Yksi tutkimusryhmän tavoitteista on muodostaa pelkästään rasvakudoksesta peräisin oleva verisuonimalli, jota varten tutkimusryhmä tarvitsee rasvakudoksesta eristettyjä endoteelisoluja.

Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia rasvakudoksen endoteelisolujen eristystä, jotta eristetyistä soluista voidaan muodostaa verisuonimalli tutkimuskäyttöön. Opinnäytetyön tarkoituksena oli eristää ihmisen rasvakudoksesta endoteelisoluja ja karakterisoida eristetyt solut. Opinnäytetyön ensimmäinen tutkimustehtävä oli eristää rasvakudoksesta endoteelisoluja MACS ja pluriBead® -menetelmillä. Toisena tehtävänä oli karakterisoida eristetyt solut morfologian, virtaussytometrian ja 2D-verisuonimallin sekä immunosytokemiallisten värjäysten avulla ja kolmantena tehtävänä oli vertailla kahta eri eristysmenetelmää, MACS ja pluriBead®, napanuoralaskimon endoteelisoluilla.

Rasvakudoksesta eristetyt solut muodostivat sekasolupopulaatioita, joissa morfologian perusteella oli hyvin vähän endoteelisoluja. Eristettyjen solujen toiminnallisuutta testattessa solut eivät osoittaneet endoteelisoluille tyypillistä kykyä muodostaa verisuonirakenteita kantasolujen tukemana. Virtaussytometriassa eristettyjä soluja karakterisoitiin pintamolekyylien avulla ja tulosten perusteella eristetyt solut ilmensivät heikosti endoteelisoluille tyypillisiä pintamolekyylejä. Menetelmiä vertaillessa havaittiin, että molemmissa menetelmissä ilmeni ongelmia vasta-aineiden sitoutumisessa kohdesoluihin.

Rasvakudosta on pidetty helppona lähteenä eri solutyypeille, mutta endoteelisolujen eristäminen osoittautui haasteelliseksi. Eristetty endoteelisolupopulaatio jäi pieneksi ja seassa oli runsaasti toista solutyyppiä, joka dominoi kasvatusalustalla. Jotta endoteelisoluja pystyttäisiin karakterisoimaan ja käyttämään verisuonimalleissa, tulisi eristetystä solupopulaatiosta saada puhtaampi ja suurempi. Pieni endoteelisolupopulaatio, joka saatiin eristettyä, osoitti lyhyessä ajassa suurta angiogeneesipotentiaalia eli kykyä muodostaa verisuonirakenteita. Rasvakudoksen endoteelisolujen eristystä voitaisiin jatkaa tutkimalla eri seerumien vaikutusta menetelmien eristyskykyyn. Eristettävää sekasolupopulaatiota voisi puhdistaa menetelmällä, jonka kohdesoluja ovat kasvualustalla dominoivat solu-tyypit. Endoteelisoluja voitaisiin myös eristää myös FACS-menetelmällä, mutta menetelmä on työläs ja vaatii paljon osaamista.

The thesis was done in the Adult Stem Cell Group of the University of Tampere. The group focuses on the cellular and molecular mechanisms that control the behavior and differentiation of human mesenchymal stem cells. One of the goals of the research group is to form a vascular model that is derived from adipose tissue entirely. For the research, the group needs endothelial cells derived from adipose tissue.

The objective of the thesis was to study the isolation of endothelial cells from adipose tissue to form a vascular model for research use. The purpose of the thesis was to isolate endothelial cells from human adipose tissue and characterize the isolated cells. The first research scheme was to isolate endothelial cells from human adipose tissue by MACS and pluriBead® methods, and the second was to characterize the isolated cells by morphology, flow cytometry, 2D angio-genesis model and immunocytochemical staining. The third scheme was to compare two different isolation methods, MACS and pluriBead®, using umbilical vein endothelial cells.

The isolated cells were a mixed cell population with a minimal number of cells with endothelial morphology. The functionality of the isolated cells was examined, and the cells did not show ability of endothelial cells to form vascular structures supported by stem cells. Surface molecules of the isolated cells were characterized by flow cytometry and according to the results, the cells did not indicate surface molecules typical to endothelial cells. Comparison of the two isolation methods showed that there was a problem with binding the antibodies to the target cells with both methods.

Adipose tissue has been considered an easy source for different cell types, but the isolation of the endothelial cells proved challenging. The isolated endothelial cell population remained minimal and there was an abundance of another cell type that dominated the cell culture. To characterize and use endothelial cells in vascular models, the isolated endothelial cell population needs to be purified and expanded. The small endothelial cell population that was isolated showed a high angiogenesis potential in a short time. Further research is required to analyze the impact of different serums during the isolation methods. Also, the mixed cell population could be purified from the cells that dominate on the cell culture by using methods that target the unwanted cells. Endothelial cells could also be isolated from mixed cell population by a FACS, but the method is demanding and requires a lot of expertise.