Yksivaiheisen RT-qPCR -testin optimointi enterovirusten tyypittämiseksi
Pirttinen, Minna (2012)
Pirttinen, Minna
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012120718644
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012120718644
Tiivistelmä
Työn tarkoituksena oli optimoida yksivaiheinen, kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (engl.one-step RT-qPCR) enterovirusten tyypittämiseksi ja verrata sen herkkyyttä kaksivaiheiseen RT-qPCR -menetelmään. Työssä monistettiin enterovirusgenomin VP1-aluetta ja siinä käytettiin templaatteina enterovirusgenomin sisältäviä geenivektoreita, virus-RNA-transkripteja ja virusviljelyssä kasvatettuja viruksia, joista oli eristetty RNA. Työssä oli tarkoitus testata myös fluoresoivien alukkeiden ja uusien fluorokromien toimivuutta, kun erilaisia kaupallisia entsyymiseoksia käytetään qPCR:ssä.
RT-qPCR -reaktion optimoinnissa testattiin kaupallista yksivaiheista (engl. one-step) menetel-mää sekä omaa ns. in-house one-step -menetelmää. Työn alkuvaiheessa tehdyissä kokeissa osoitettiin, että kaupallinen menetelmä toimi huonosti, ja tämän takia työn seuraavissa vaiheissa keskityttiin ainoastaan yksivaiheisen in-house -menetelmän optimointiin. Optimoinnissa keski-tyttiin erityisesti RT-qPCR -reaktion reagenssipitoisuuksiin, joista MgCl2 -pitoisuutta optimoitiin eniten. Cy5-leimatun alukkeen toimivuutta verrattiin leimaamattomaan alukkeeseen qPCR-ajoissa. SYTO9- ja SYTO82 -fluorokromeja verrattiin SYBR Green I -fluorokromin toimivuuteen Rotor Gene -laitteistossa.
Yksivaiheisen RT-qPCR -menetelmän toimivuutta saatiin merkittävästi testattua ja optimoitua, mutta menetelmällä ei saavutettu kaksivaiheisen menetelmän herkkyyttä. qPCR:ssä ei havaittu merkittäviä eroja, jos käytettiin joko Cy5-leimattuja tai leimaamattomia alukkeita. SYBR Green I toimi fluorokromina paremmin kuin SYTO 9- ja SYTO 82 -fluorokromit, mutta työ vaatii jatkotutkimuksia.
RT-qPCR -reaktion optimoinnissa testattiin kaupallista yksivaiheista (engl. one-step) menetel-mää sekä omaa ns. in-house one-step -menetelmää. Työn alkuvaiheessa tehdyissä kokeissa osoitettiin, että kaupallinen menetelmä toimi huonosti, ja tämän takia työn seuraavissa vaiheissa keskityttiin ainoastaan yksivaiheisen in-house -menetelmän optimointiin. Optimoinnissa keski-tyttiin erityisesti RT-qPCR -reaktion reagenssipitoisuuksiin, joista MgCl2 -pitoisuutta optimoitiin eniten. Cy5-leimatun alukkeen toimivuutta verrattiin leimaamattomaan alukkeeseen qPCR-ajoissa. SYTO9- ja SYTO82 -fluorokromeja verrattiin SYBR Green I -fluorokromin toimivuuteen Rotor Gene -laitteistossa.
Yksivaiheisen RT-qPCR -menetelmän toimivuutta saatiin merkittävästi testattua ja optimoitua, mutta menetelmällä ei saavutettu kaksivaiheisen menetelmän herkkyyttä. qPCR:ssä ei havaittu merkittäviä eroja, jos käytettiin joko Cy5-leimattuja tai leimaamattomia alukkeita. SYBR Green I toimi fluorokromina paremmin kuin SYTO 9- ja SYTO 82 -fluorokromit, mutta työ vaatii jatkotutkimuksia.