Yksivaiheisen RT-qPCR -testin optimointi enterovirusten tyypittämiseksi

Abstract

Työn tarkoituksena oli optimoida yksivaiheinen, kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (engl.one-step RT-qPCR) enterovirusten tyypittämiseksi ja verrata sen herkkyyttä kaksivaiheiseen RT-qPCR -menetelmään. Työssä monistettiin enterovirusgenomin VP1-aluetta ja siinä käytettiin templaatteina enterovirusgenomin sisältäviä geenivektoreita, virus-RNA-transkripteja ja virusviljelyssä kasvatettuja viruksia, joista oli eristetty RNA. Työssä oli tarkoitus testata myös fluoresoivien alukkeiden ja uusien fluorokromien toimivuutta, kun erilaisia kaupallisia entsyymiseoksia käytetään qPCR:ssä. RT-qPCR -reaktion optimoinnissa testattiin kaupallista yksivaiheista (engl. one-step) menetel-mää sekä omaa ns. in-house one-step -menetelmää. Työn alkuvaiheessa tehdyissä kokeissa osoitettiin, että kaupallinen menetelmä toimi huonosti, ja tämän takia työn seuraavissa vaiheissa keskityttiin ainoastaan yksivaiheisen in-house -menetelmän optimointiin. Optimoinnissa keski-tyttiin erityisesti RT-qPCR -reaktion reagenssipitoisuuksiin, joista MgCl2 -pitoisuutta optimoitiin eniten. Cy5-leimatun alukkeen toimivuutta verrattiin leimaamattomaan alukkeeseen qPCR-ajoissa. SYTO9- ja SYTO82 -fluorokromeja verrattiin SYBR Green I -fluorokromin toimivuuteen Rotor Gene -laitteistossa. Yksivaiheisen RT-qPCR -menetelmän toimivuutta saatiin merkittävästi testattua ja optimoitua, mutta menetelmällä ei saavutettu kaksivaiheisen menetelmän herkkyyttä. qPCR:ssä ei havaittu merkittäviä eroja, jos käytettiin joko Cy5-leimattuja tai leimaamattomia alukkeita. SYBR Green I toimi fluorokromina paremmin kuin SYTO 9- ja SYTO 82 -fluorokromit, mutta työ vaatii jatkotutkimuksia.

The purpose of this thesis was to optimize the one-step real-time reverse transcription polymer-ase chain reaction (RT-qPCR) method for enterovirus typing and to compare its sensitivity with the two-step method. The target gene to be amplified was the enteroviral VP1 gene, and the templates included enteroviral cDNA clones, viral RNA transcripts, and viral RNA isolated from virus particles. The functionality of new fluorescent primers and fluorochromes in commercial RT-qPCR assays was also tested. In the early stage of the study, a commercial one-step method was compared with the in-house one-step method and found to be less sensitive. The commercial method was therefore reject-ed, and the rest of the working time was used to optimize the in-house method. The main focus was on the reaction components, particularly the concentration of MgCl2. The effect of a Cy5-labelled primer on the sensitivity of qPCR was compared with an unlabelled primer. The fluo-rescence properties of SYTO9 and SYTO82 fluorochromes were compared SYBR with Green I in Rotor Gene apparatus. Even though the one-step method was significantly optimized and sensitized, its sensitivity was not comparable with that of the two-step method. The Cy5-labelled primer did not lower the sensitivity of the RT-qPCR method. In a few assays carried out with fluorochromes it was evi-dent that SYBR Green I was a better fluorochrome than SYTO 9- or SYTO 82, but more exper-imentation is needed to demonstrate the apparent differences which they have in functionality.