Authentication of β-Carbonic Anhydrase Gene Silencing in Drosophila melanogaster

Abstract

One widely used organism in the field of genetic research is Drosophila melanogaster, the fruit fly. Drosophila can be considered as an ethically acceptable model organism. Moreover, it is easy to grow and the progeny development is fast and plentiful. For instance, different kinds of loss-of-function studies can be performed using fruit flies, such as silencing of the β-carbonic anhydrase gene. Carbonic anhydrases control the acid-base regulation as well as many other physiological pathways in different organisms. β-class carbonic anhydrases can be found in plants and invertebrates but not in vertebrates.

The objective of this Bachelor’s thesis was to generate a fruit fly population in which β-carbonic anhydrase gene could be silenced by using a hormone containing media, and to authenticate the silencing with different approaches. The purpose was to establish the methods for authentication and to identify optimal hormone concentration for gene silencing.

To achieve silencing, RNA interference and UAS-GAL4 -systems were used with hormone based media. The gene expression levels were studied with quantitative polymerase chain reaction. In addition, immunoblotting was also conducted to examine the protein level changes, and histological samples were studied to find out the occurrence of β-carbonic anhydrase in the fly tissue.

Alterations in gene expression were discovered although the data obtained from qPCR were not altogether consistent. The immunoblotting results suggest that the antibody used did not function as desired. Histological stainings were adjusted and improved, but the findings are challenging to evaluate. In the future it would be desirable to cross different fly stocks and increase the sample amount. The studies will continue with methods established in this work.

Drosophila melanogaster on laajalti käytetty malliorganismi geneettisten sairauksien tutkimisessa, sillä useat ihmisen tautigeenit löytyvät tältä selkärangattomalta vastingeeneinä. Banaanikärpästä voidaan pitää eettisesti hyväksyttävänä mallieläimenä, jonka ylläpito on helppoa ja jälkeläismäärät suuria. Hiilihappoanhydraasit taas esiintyvät eri muodoissa eukaryooteissa ja prokaryooteissa. Nämä entsyymit osallistuvat organismin pH-tasapainon säätelyyn ja myös muihin tärkeisiin fysiologisiin prosesseihin. β-hiilihappoanhydraasia esiintyy pääasiassa selkärangattomissa ja kasveissa.

Opinnäytetyön tavoitteena oli eri D. melanogaster -kantoja risteyttämällä saada aikaan populaatio, jonka β-hiilihappoanhydraasi -geeni on mahdollista hiljentää lääkeruoan avulla. Tarkoituksena oli tutkia missä lääkeruokapitoisuudessa geeni hiljentyy, sekä etsiä ja pystyttää sopivia menetelmiä hiljentymisen todentamiseen.

RNA interferenssiä ja GAL4-UAS -menetelmää apuna käyttäen saatiin aikaan hiljennyksessä käytettävä jälkeläissukupolvi. Hiljentymistä tutkittiin geenin ekspression kautta kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla. Hiljentyminen pyrittiin myös osoittamaan proteiinitasolla western blot -menetelmällä ja histologisten värjäysten avulla pyrittiin toteamaan β-hiilihappoanhydraasin esiintyminen kudoksissa.

Viitteitä β-hiilihappoanhydraasi -geenin hiljentymisestä saatiin geenitasolla, joskin tulokset eivät olleet täysin johdonmukaisia. Immunoblottaus -menetelmästä saatujen tulosten mukaan käytetty vasta-aine ei toiminut täysin toivotusti. Histologisia värjäyksiä saatiin kehitettyä, joskin tuloksia hiljentymisestä on vaikea tulkita. Tutkimuksia jatketaan tutkimusryhmässä työssä pystytettyjä menetelmiä ja saatuja tuloksia apuna käyttäen. Tulevaisuudessa hiljentymistä voitaisiin tutkia eri kärpäslinjoilla ja suuremmalla näytemäärällä.