Influenssa B viruksen nukleoproteiinia tuottavan Pichia pastoris-kannan luominen
Kartesalo, Anna-Kaisa (2012)
Kartesalo, Anna-Kaisa
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012121719708
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012121719708
Tiivistelmä
INFLUENSSA B-VIRUKSEN NUKLEOPROTEIINIA TUOTTAVAN PICHIA PASTORIS-KANNAN LUOMINEN
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää geeniteknisin menetelmin Pichia pastoris-hiivakanta, joka tuottaa influenssa B-viruksen nukleoproteiinia (InBNP) fuusioituna merkkiproteiiniin. Erilaisia geenikonstrukteja tehtiin yhteensä kuusi kappaletta, joiden erona oli erilainen promoottori tai merkkiproteiini.
Työ tehtiin HydroBody-projektissa, joka on Turun AMK:n ja VTT:n yhteistyöprojekti ja jonka tarkoituksena on kehitellä uusia tuottokonsepteja teollisesti arvokkaille proteiineille (http://hydrobody.turkuamk.fi/). Projektin nimi HydroBody tulee sanasta hydrofobiini, joka on alun perin rihmasienten tuottama monipuolinen pieni proteiini. Hydrofobiinin ainutlaatuisten ominaisuuksien vuoksi se voidaan konsentroida surfaktantti-pohjaisessa kaksifaasiuutossa faasista toiseen. Tällöin myös kohdeproteiinin puhdistus helpottuu käytettäessä hydrofobiinia merkkiproteiinina proteiinintuotannossa.
Erilaisia Pichia pastorikseen transformoitavia vektoreita on kaksi kappaletta, PICZ A ja GAPZ A. PICZ A on metanoli-indusoitava proteiinituotannon aloittamiseksi ja GAPZ A:ssa proteiinin tuotto on aina päällä johtuen erilaisista promoottoreista. Erilaisia proteiinia tuottavia geenejä valmistettiin kolme kappaletta, joista kaikki tuottavat InBNP:tä, vain merkkiproteiini muuttuu. Kaikki geenit ilmennettiin molempien promootterien yhteydessä, jolloin lopulta päästiin kuuteen erilaiseen InBNP:tä tuottavaan kantaan.
Lopuksi Pichia pastoris-kannat testattiin InBNP-tuottotasojen selvittämiseksi yhteistyössä ArcDian kanssa käyttäen MariPOC-testimenetelmää. Mittauksissa todettiin tuottokantojen tuottavan nukleoproteiinia muodossa, jonka laitteisto tunnistaa sekä pystyttiin alustavasti seulomaan paremmin tuottavat kannat huonommista.
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää geeniteknisin menetelmin Pichia pastoris-hiivakanta, joka tuottaa influenssa B-viruksen nukleoproteiinia (InBNP) fuusioituna merkkiproteiiniin. Erilaisia geenikonstrukteja tehtiin yhteensä kuusi kappaletta, joiden erona oli erilainen promoottori tai merkkiproteiini.
Työ tehtiin HydroBody-projektissa, joka on Turun AMK:n ja VTT:n yhteistyöprojekti ja jonka tarkoituksena on kehitellä uusia tuottokonsepteja teollisesti arvokkaille proteiineille (http://hydrobody.turkuamk.fi/). Projektin nimi HydroBody tulee sanasta hydrofobiini, joka on alun perin rihmasienten tuottama monipuolinen pieni proteiini. Hydrofobiinin ainutlaatuisten ominaisuuksien vuoksi se voidaan konsentroida surfaktantti-pohjaisessa kaksifaasiuutossa faasista toiseen. Tällöin myös kohdeproteiinin puhdistus helpottuu käytettäessä hydrofobiinia merkkiproteiinina proteiinintuotannossa.
Erilaisia Pichia pastorikseen transformoitavia vektoreita on kaksi kappaletta, PICZ A ja GAPZ A. PICZ A on metanoli-indusoitava proteiinituotannon aloittamiseksi ja GAPZ A:ssa proteiinin tuotto on aina päällä johtuen erilaisista promoottoreista. Erilaisia proteiinia tuottavia geenejä valmistettiin kolme kappaletta, joista kaikki tuottavat InBNP:tä, vain merkkiproteiini muuttuu. Kaikki geenit ilmennettiin molempien promootterien yhteydessä, jolloin lopulta päästiin kuuteen erilaiseen InBNP:tä tuottavaan kantaan.
Lopuksi Pichia pastoris-kannat testattiin InBNP-tuottotasojen selvittämiseksi yhteistyössä ArcDian kanssa käyttäen MariPOC-testimenetelmää. Mittauksissa todettiin tuottokantojen tuottavan nukleoproteiinia muodossa, jonka laitteisto tunnistaa sekä pystyttiin alustavasti seulomaan paremmin tuottavat kannat huonommista.