Influenssa B viruksen nukleoproteiinia tuottavan Pichia pastoris-kannan luominen

Abstract

INFLUENSSA B-VIRUKSEN NUKLEOPROTEIINIA TUOTTAVAN PICHIA PASTORIS-KANNAN LUOMINEN

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää geeniteknisin menetelmin Pichia pastoris-hiivakanta, joka tuottaa influenssa B-viruksen nukleoproteiinia (InBNP) fuusioituna merkkiproteiiniin. Erilaisia geenikonstrukteja tehtiin yhteensä kuusi kappaletta, joiden erona oli erilainen promoottori tai merkkiproteiini. Työ tehtiin HydroBody-projektissa, joka on Turun AMK:n ja VTT:n yhteistyöprojekti ja jonka tarkoituksena on kehitellä uusia tuottokonsepteja teollisesti arvokkaille proteiineille (http://hydrobody.turkuamk.fi/). Projektin nimi HydroBody tulee sanasta hydrofobiini, joka on alun perin rihmasienten tuottama monipuolinen pieni proteiini. Hydrofobiinin ainutlaatuisten ominaisuuksien vuoksi se voidaan konsentroida surfaktantti-pohjaisessa kaksifaasiuutossa faasista toiseen. Tällöin myös kohdeproteiinin puhdistus helpottuu käytettäessä hydrofobiinia merkkiproteiinina proteiinintuotannossa. Erilaisia Pichia pastorikseen transformoitavia vektoreita on kaksi kappaletta, PICZ A ja GAPZ A. PICZ A on metanoli-indusoitava proteiinituotannon aloittamiseksi ja GAPZ A:ssa proteiinin tuotto on aina päällä johtuen erilaisista promoottoreista. Erilaisia proteiinia tuottavia geenejä valmistettiin kolme kappaletta, joista kaikki tuottavat InBNP:tä, vain merkkiproteiini muuttuu. Kaikki geenit ilmennettiin molempien promootterien yhteydessä, jolloin lopulta päästiin kuuteen erilaiseen InBNP:tä tuottavaan kantaan. Lopuksi Pichia pastoris-kannat testattiin InBNP-tuottotasojen selvittämiseksi yhteistyössä ArcDian kanssa käyttäen MariPOC-testimenetelmää. Mittauksissa todettiin tuottokantojen tuottavan nukleoproteiinia muodossa, jonka laitteisto tunnistaa sekä pystyttiin alustavasti seulomaan paremmin tuottavat kannat huonommista.

CREATION OF INFLUENZA B VIRUS NUCLEOPROTEIN PRODUCING PICHIA PASTORIS STRAIN

The aim of this Bachelor Thesis was to create a Pichia pastoris yeast strain that produces the nucleoprotein of Influenza B virus (InBNP) combined to a tag protein. Six different versions of the InBNP producing construct were created, each differing from the others by a different tag protein or vector in which the construct was introduced to Pichia. The practical part of the thesis was performed as part of the HydroBody project, which is a joint project between Turku University of Applied Sciences and VTT, in the protein production laboratories at TUAS. The project aims to develop new production concepts for industrially valuable proteins. The project name HydroBody, comes from the word hydrophobin which is a small protein produced by filamentous fungi. As a result of the versatile and exceptional properties of the protein it can be concentrated from one phase to another by surfactant-based two-phase extraction thus facilitating the purification of the target fusion protein, InBNP. Pichia pastoris was transformed by two different vectors, PICZ A and GAPZ A. PICZ A has to be induced by methanol to initiate protein production whereas the production in GAPZ A is always on resulting from different promoters integrated into the vector. Three different protein-coding genes were prepared all of them producing InBNP but varying in tag protein. All genes were expressed combined to both vectors resulting in six different InbNP-producing vectors. Finally the Pichia strains created were tested for their level of InBNP production in cooperation with ArcDia International using their MariPOC testing method. In the measurements strains were proven to produce InBNP in a form recognized by the testing device and initial screening of strains could be performed based on the gathered data.