Fusarium-sienen määrittäminen vilja-aineistosta Q-PCR menetelmällä

Abstract

Fusarium on homesienisuku, johon kuuluvia lajeja esiintyy monilla kasvilajeilla, kuten viljoilla. Viljoille Fusarium-sienet aiheuttavat erilaisia tauteja ja osa lajeista tuottaa myös mykotoksiineja eli sienimyrkkyjä. Toksiinit ovat ihmisille haitallisia ja niille on tämän takia määritetty EU:ssa korkein sallittu pitoisuus. Yksi yleisimmistä Fusarium-sienten tuottamista mykotoksiineista on deoksinivalenoli (DON). Fusarium-sienet ovat enenevissä määrin ongelma osittain johtuen niille suotuisista ilmasto-olosuhteista etenkin sateisina kesinä.

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli sisäänajaa ja testata menetelmä Fusarium-sienen määrittämiseen viljoissa Bio-Radin iCycler laitteella. Työ tehtiin Boreal Kasvinjalostus Oy:lle alustavaksi menetelmäksi olemassaolevien vilja-lajikkeiden Fusarium-kestävyyteen liittyvissä tutkimuksissa. Työssä käytettiin aikaisemmissa tutkimuksissa käytettyjä Fusarium graminearum ja Fusarium culmorum -lajispesifisiä alukkeita ja koettimia. Työssä hyödynnettiin hydrolyysiin perustuvaa TaqMan-koetinta. Tutkittavat jauhonäytteet olivat peräisin MTT:ltä, jossa niiden DON-pitoisuus mitattiin kemiallisesti. Näytteet valikoitiin niiden DON-pitoisuuden perusteella. Jokainen näyte sisälsi DON-toksiinia pitoisuuden ollessa välillä 28 - 2600 µg/kg.

Kokeissa mitattiin onnistuneesti Fusarium graminearum -lajin pitoisuuksia kaurassa, ohrassa ja vehnässä. Tarkoituksena oli myös tarkastella Fusarium-DNA-pitoisuuden ja DON-toksiinin korrelaatiota. Kokeissa havaittiin positiivinen korrelaatio DON-pitoisuuden ja Fusarium graminearum-DNA-pitoisuuden välillä. Menetelmää on mahdollista käyttää alustavissa Fusarium-kestävyyteen liittyvissä tutkimuksissa, mutta menetelmän ollessa verrattain hidas ja hintava on tarve tehokkaammalle menetelmälle.

Fusarium is a large genus of fungi which infect several species of plants including different grains. Fusarium may cause several different illnesses in grains and some Fusarium species also produce mycotoxins. The toxins are harmful to humans, wherefore the European Union has defined the maximum level of some mycotoxins in grains. One of the most common mycotoxins is deoxynivalenol (DON). Fusarium causes more problems now than ever before, partly because the weather conditions are beneficial to their growth and mycotoxin production.

The aim of this thesis was to introduce and test a method of quantitating Fusarium in grains by Q-PCR using Bio-Rad’s iCycler Q-PCR device. The project was commissioned by Boreal Plant Breeding Ltd. and its purpose was to be able to use the method in analysis of resistance of existing grain breeds against Fusarium. The Fusarium graminearum and Fusarium culmorum species specific primers used in this thesis were ones used in previously published studies. TaqMan hydrolysis probes were utilised. The grain flour samples used in this thesis were obtained from MTT, where their DON concentration was chemically quantified. The samples were selected by their DON concentration. Every sample contained between 28 and 2600 µg/kg of DON toxin.

The concentration of Fusarium graminearum was successfully quantified in oat, barley and wheat samples. The correlation between the Fusarium DNA and DON concentrations of Fusarium was also examined. A positive correlation between the DNA and DON concentrations of Fusarium was discovered. It is possible to use this method for analysis of resistance against Fusarium, but it is a relatively slow and expensive method, which creates a need for a more efficient one.