Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-menetelmän pystyttäminen patogeenisten A-ryhmän streptokokkien osoitusdiagnostiikkaa varten

Abstract

Streptococcus pyogenes -bakteerin eri kannoista käytetään yhteisnimitystä A-ryhmän streptokokit. A-ryhmän streptokokit aiheuttavat ihmiselle immuunipuolustuksen heiketessä infektiosairauksia, joista yleisin on nielurisatuledus. Hoitamattomana Streptokokki A voi aiheuttaa vakavan yleisinfektion, joka pahimmillaan voi johtaa potilaan kuolemaan. Tämän vuoksi bakteerin nopea ja luotettava diagnosointi on tärkeää. Tämä on kuitenkin haastavaa, sillä Streptococcus pyogeneksesta tunnetaan satoja eri kantoja, joilla kaikilla on erilaiset geenisekvenssit. Lisäksi myös jotkin S. pyogeneksen kanssa lähisukuiset bakteerit, kuten Streptococcus dysgalactiae subs. equisimilis ilmentävät A-ryhmän streptokokkien diagnosointiin perinteisesti käytettyä Lancefieldin A-ryhmän antigeeniä.

Tutkimus toteutettiin ArcDia International Oy Ltd:n toimeksiantona. Tutkimuksen tarkoituksena oli pystyttää reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-menetelmä, joka olisi vähintään yhtä herkkä kuin yhtiön kehittämä mariPOC®-pikatestimenetelmä. Testeillä saatuja tuloksia voitaisiin tällöin verrata keskenään, ja varmentaa mariPOC®:illa saatuja matalia positiivisia testituloksia. Työn tavoitteena oli testata Molekyylidiagnostiikan laboratorion testeissä aiemmin optimoituja alukkeita ja lyhyttä UPL-hydrolyysikoetinta ja tutkia eri sterptokokkilajien puhdasviljelmänäytteiden sekä kliinisten potilasnäytteiden reagoimista qPCR-testissä.

Tutkimuksessa päästiin vaiheeseen, jossa testillä voitiin todeta positiivisiksi näytteet, joiden kohdebakteeripitoisuus 357 bakteeria näytekuopassa (10 µl). MariPOC®:in tarkkuus puolestaan on 500 CFU millilitrassa. Testeissä Streptococcus mitis reagoi tuottaen väärän positiivisen tuloksen, joten testiin valittu koetin ei ollut riittävän spesifinen. Seuraavat vaiheet testin kehittämisessä ovat pidemmän ja spesifisemmän koettimen, positiivisen kontrollitemplaatin (kohde-DNA:n kvantitatointi standardisuoralta) sekä sisäisen kontrollitemplaatin (testin toiminnan ja negatiivisten tulosten varmentaminen) suunnittelu ja testaaminen.

The different strains of Sterptococcus pyogenes are commonly referred to as Group A Streptococci. When the body immune system weakens, Group A Streptococci may cause infectious diseases. The most common of these diseases is pharyngitis. If untreated, Group A streptococci may cause a severe general infection which at its worst may lead to death. This is why fast and accurate diagnostics of the bacterium is important. This can, however, be challenging as there are hundreds of identified strains of Streptococcus pyogenes, all of which have different genomes. In addition some closely related species such as Streptococcus dysgalactiae subs. equisimilis express the Lancefield group A antigen which has traditionally been used for the diagnostics of Group A streptococci.

The study was commissioned by ArcDia International Oy Ltd. The objective of the study was to set up a quantitative real-time PCR assay which would be as sensitive as the company's mariPOC® point-of-care assay. This would enable the comparison of the test results acquired with both tests and hence the verification of the low positive results acquired with the mariPOC® assay. The goal in this thesis was to test the primers and the short UPL hydrolysis probe which had been optimized in the earlier studies in the Molecular Diagnostic Laboratory and to study the responses in the qPCR test of both pure culture samples of different Streptococcus species and clinical samples.

The study reached a point where samples which contained 357 bacteria in a sample well (10 µl) gave a positive response, whereas the test accuracy of MariPOC® is 500 CFU/ml. In the test Streptococcus mitis gave a false positive response so the probe which had been selected for the test was not sufficiently specific. The next phases in the development of the test are the desig and testing of a longer, more specific probe, the design and testing of a positive control template (for quantification of the target DNA from a standard curve) and the design and testing of an internal control template (for verification of the functionality of the test and the negative results).