Määritysmenetelmän kehittäminen proteiiniadsorption tutkimiseen nanopartikkeleista

Abstract

Opinnäytetyö suoritettiin Turun yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan Biofysiikan laboratoriossa. Työ edisti osaltaan laboratorion tavoitteita kehittää uusia menetelmiä biomolekyylien vuorovaikutusten tutkimiseen luminesenssiin pohjautuvin menetelmin. Kehitetyn menetelmän oli tarkoitus määrittää nanopartikkelien pinnoille tapahtuvan proteiiniadsorption täyttöastetta. Menetelmä perustui aikaerotteiseen fluoresenssiin ja resonanssienergian siirtoon (RET) europiumkelaattia sisältävien nanopartikkelien ja leimatun proteiinin välillä. Leimattu proteiini toimi RET-parin akseptorina ja kilpaili adsorboitumisesta näytepartikkeleihin adsorboituneen proteiinin kanssa. Leimatun proteiinin sitoutuminen näytepartikkeleihin heikensi RET-signaalia, joten RET-signaalin ja adsorption asteen välillä oli korrelaatio. Työssä verrattiin kehitettyä menetelmää kirjallisuudessa esitettyyn menetelmään, jossa näyteproteiini leimattiin europiumkelaatilla. Menetelmien havaittiin antavan tietoa proteiiniadsorption täyttöasteesta toisiaan vastaavilla tarkkuuksilla. Selvitettiin myös näytteen pitoisuuden ja näytepartikkelien koon vaikutusta määritykseen. Havaittiin, että näytemäärää säätelemällä voitiin paremmin havaita eroja tietyillä adsorption täyttöasteilla, sillä näytepartikkelien kokonaispinta-ala muuttui määrityksessä suhteessa näytteen pitoisuuteen. Näytemäärää lisäämällä voitaisiin siis havaita eroja paremmin esimerkiksi lähes saturoituneista partikkeleista. Proteiiniadsorption astetta voitiin mitata eri kokoisista ja hieman erilaisia pinnan ominaisuuksia omaavista partikkeleista. Yritettiin myös kehittää menetelmä, jossa näytepartikkelien pesuvaihe voitaisiin jättää pois ja mitata adsorpoitumatta jääneen proteiinin pitoisuuden laskua. Menetelmää ei vielä saatu toimimaan ilman pesuvaihetta, mutta tarkempi tutkimus voi osoittaa pesuvaiheen turhaksi. Kehitetyllä menetelmällä on potentiaalia nopeaksi ja tarkaksi proteiiniadsorption asteen mittausmenetelmäksi. Menetelmän käytettävyyttä rajoittaa vain leimatun proteiinin adsorboituvuus näytemateriaalin pinnalle.

The thesis project was conducted in the Laboratory of Biophysics of the Faculty of Medicine, University of Turku. The study was performed to promote the recent efforts of the Laboratory to develop novel luminescence-based methods for investigating the interactions of biomolecules. The method was developed for the determination of the degree of protein adsorption onto nanoparticles. It was based on the time-resolved fluorescence and resonance energy transfer (RET) between nanoparticles doped with a europium chelate and a labeled protein. The labeled protein acted as the acceptor of the RET pair and competed in adsorption with the protein adsorbed onto the particles in the sample.. The adsorption of the labeled protein onto the sample decreased the RET signal. Thus, there was a correlation between the degree of adsorption and the RET signal. The developed method was compared to a literature method in which the sample protein was labeled with a europium chelate. Both methods were observed to give information on the degree of protein adsorption with similar accuracy. The effects of sample concentration and the size of sample particles on the method were also assessed. It was observed that the alteration of the sample concentrations enabled improved distinction of the degree of adsorption at certain surface coverages as the sample concentration is relative to the total surface area in the sample. Alteration of the sample concentration could thus provide more detailed information, for example, on the slight differences near saturation. The degree of protein adsorption was also found to be measurable from particles of different sizes and slightly different surface properties. A method was also investigated to measure the decrease in non-adsorbed protein due to adsorption leaving out the washing steps of samples. The results of this test were preliminary, but further studies may prove the sample washing step unnecessary. The developed method is potentially a fast and accurate assay for studying the degree of protein adsorption on an extensive range of sample materials. The range of sample materials is limited to those adsorbing the labeled protein.