Immunohistokemiallisten värjäysmenelmien pystytys hiiren kudosleikkeille

Abstract

Immunohistokemialliset värjäysmenetelmät ovat kehittyneet huomattavasti viime vuosien aikana ja tulleet tärkeiksi tutkimustyökaluiksi erityisesti biologiaan liittyvillä aloilla. Useat asiat vaikuttavat värjäysten laatuun tehden siitä ajoittain haastavaa. Opinnäytetyön tarkoituksena oli pystyttää kaksi erillistä immunohistokemiallista värjäysmenetelmää liittyen kahteen eri tutkimukseen ja keskittyä erityisesti värjäysten tuomiin haasteisiin. Ensimmäisessä tutkimuksessa pyrittiin havaitsemaan α2A-adrenoseptorisiirtogeenin ilmeneminen hiiren kudoksessa hemagglutiniiniepitoopin (HA) avulla. Immunohistokemialliset värjäykset suoritettiin, koska haluttiin varmuus siitä, että siirtogeeni ilmenee hiiressä myös proteiinitasolla. Sekä fluoresenssivärjäystä että epäsuoraa avidiini-biotiinikompleksimenetelmää (ABC) kokeiltiin värjäyksen pystytyksessä. Värjäysprotokolla pyrittiin optimoimaan lisämunuaisleikkeillä, mutta kuorikerroksella ilmenevän autofluoresenssin johdosta fluoresenssivärjäyksestä luovuttiin. Primaarivasta-aineena käytettiin polyklonaalista kanissa tuotettuja HA-vasta-ainetta. Tulokset pysyivät negatiivisina huolimatta useista vasta-aineiden pitoisuuksien ja inkubaatioaikojen muutoksista sekä esikäsittelystä liittyen antigeenien paljastukseen. Myös värjäykset toisen eri valmistajan HA-vasta-aineen kanssa tuottivat samankaltaisia tuloksia. Lopulta molempien HA-vasta-aineiden soveltuvuus värjäyksiin testattiin toimivaksi todetulla immunosytokemiallisella fluoresenssivärjäyksellä. Positiivisena kontrollina käytettiin monoklonaalista hiiressä tuotettua vasta-ainetta. Samaa protokollaa noudattaen suoritettiin värjäykset molemmilla HA-vasta-aineilla useita laimennuksia käyttäen. Kummankaan vasta-aineen kohdalla ei selvästi havaittavaa värjäytymää syntynyt. Tulosten perusteella vastaaineet eivät todennäköisesti soveltuneet kyseisiin värjäyksiin. Toinen tutkimus liittyi melanokortiini-4 reseptorin havainnointiin hiiren sydänkudoksessa. Primaarivasta-aineena käytettiin kanissa tuotettua polyklonaalista vasta-ainetta. ABC-menetelmällä tehtiin useita värjäyksiä muuttaen vasta-aineiden laimennussuhteita ja inkubaatioaikoja. Myös antigeenien paljastusta kokeiltiin. Kaikki tulokset olivat kuitenkin negatiivisia.

Immunohistochemical staining methods have advanced considerably over the recent years and become a powerful investigative tool for scientists of all aspects of biology. Several factors affect the staining quality making the procedure demanding. The purpose of this thesis was to set up an immunohistochemical staining method for two separate studies and especially to focus on the challenges related to the staining protocol. The first study was based on the detection of α2A-adrenoceptor transgene expression by using a hemagglutinin (HA) epitope tag. To ensure successful generation of the desired mouse line which exclusively expresses α2A-receptors in adrenergic cells, immunohistochemical staining was performed. Both immunofluorescence and an indirect avidin-biotin complex method (ABC) were used. Since the staining was optimized with adrenal gland tissue, the immunofluorescence turned out to be unsuitable due to autofluorescence in the cortex of the organ. Polyclonal antibody which was produced in rabbit was used as the primary antibody. Despite several changes in dilutions, incubation times and the use of epitope retrieval pre-treatment, the results remained negative. Staining experiments with another polyclonal primary antibody from a different manufacturer were conducted with similar results. Finally the efficiency of both primary antibodies was tested by using a method known to be an effective immunocytochemical staining method. Monoclonal antibody produced in mice was used as a positive control. The same protocol was followed, using several different dilutions of the two polyclonal antibodies. The results of both polyclonal antibodies showed either weak staining or were completely negative. It can be stated that most likely the polyclonal antibodies used in this study were unsuitable for the purpose. The second study was based on a research related to the melanocortin-4 receptor. The indirect ABC method was used to detect melanocortin-4 receptors in mouse heart tissue. Polyclonal antibody produced in rabbit was used as the primary antibody. Several staining experiments were conducted with some changes in antibody dilutions and incubation times. Also heat induced epitope retrieval was tried due to doubt of overfixation. All results remained negative. Both studies are still underway in Turku University.