PCR-MENETELMÄN OPTIMOINTI KIHOMADON DNA:N OSOITTAMISEKSI ULOSTEESTA

Abstract

Molekyylibiologisten menetelmien käyttö lisääntyy monissa mikrobiologian laboratorioissa, koska niiden avulla voidaan osoittaa spesifisesti ja sensitiivisesti tutkittavan DNA:n olemassaoloa näytteessä. Yleisin menetelmistä on PCR (Polymerase Chain Reaction) eli polymeraasiketjureaktio, jolla monistetaan DNA:ta. DNA:n monistamisen jälkeen voidaan monistettu DNA havaita erilaisilla visualisointimenetelmillä.

XXX. Opinnäytetyössä optimoitiin kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen PCR-menetelmän kihomatojen osoittamiseksi ulosteesta. Tämän työn PCR-menetelmän optimointi käsittää alukkeiden suunnittelun ja erilaisten reagenssipitoisuuksien testaamisen, sekä reaktiolämpötilojen säätämisen optimaalisiksi. Lisäksi testattiin eristysmenetelmien toimivuutta kihomadon eristämiseksi ulostenäytteistä kahdella eri menetelmällä. Eristysmenetelminä olivat silikapohjainen käsieristysmenetelmä (QIAamp DNA Stool mini kit) ja automaattilaitteella tehtävä magneettipartikkeleihin perustuva menetelmä (MagNA Pure).

PCR-menetelmistä reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR osoittautui paremmin toimivaksi, koska sen herkkyys ja toistettavuus oli testauksissa parempi kuin kvalitatiivisen PCR:n. XXX. Eristysmenetelmistä kummatkin toimivat, mutta automaattisella eristyslaitteella tehtävä eristysmenetelmä sopii laboratorion käyttöön paremmin, koska se mahdollistaa suurempien näytemäärien eristämisen aikaa säästäen.

The use of molecularbiology methods is increasing in microbiology laboratories be-cause of their sensitivity and specificity. The most common method is PCR (Polymerase Chain Reaction) which is used to copy DNA. XXX. The purpose of this bachelor’s thesis is to optimize quantitative and qualita-tive polymerase chain reaction to pinworms DNA. In the optimization we used two DNA-polymerase enzymes, different MgCl2 concentrations and annealing tempera-tures. We also used two DNA-isolation methods. We found out that the quantitative PCR is more sensitive and specific than the qua-litative PCR in the cloning of pinworms DNA. In qualitative PCR results were ob-tained only with DyNAzymeTM DNA-polymerase. XXX.