Biokaasuprosessin metanogeenisten bakteerien määrittäminen : menetelmän kehitys

Abstract

Opinnäytetyössä kehitettiin menetelmä metanogeenisten bakteerien määrittämiseen biokaasureaktorista 454-pyrosekvensointimenetelmällä. Tavoitteena oli määrittää biokaasureaktorin metanogeenien bakteeripopulaation lähtötaso tiettyinä aikapisteinä mcrA-geenin avulla. Opinnäytetyö tehtiin Turun ammattikorkeakoulun T&K-projekti Susbiolle ja työssä analysoitiin pilot-mittakaavan biokaasureaktoria. Työn teoriaosassa käsitellään anaerobista mädätystä, metanogeenisiä bakteereita, sekvensoinnin teoriaa sekä metaaninmuodostuksessa toimivan koentsyymin rakenneosan geenisekvenssiä. Käytännön työssä käsitellään menetelmän kehitystä eli näytteiden esikäsittelyä, PCR-menetelmällä tuotettavien sekvensoitavien näytteiden valmistusta ja sekvensointia GS Junior-laitteella. Menetelmä vaikuttaa alustavien testauksien mukaan toimivalta. Raakadataa analysoitiin Mothur-ohjelmalla, jolloin ensimmäisen aikapistemäärityksen tuloksena oli yli 7000 uniikkia sekvenssiä. Seuraavissa aikapistemäärityksissä uniikkien sekvenssien määrä putosi noin puoleen ensimmäisestä määrityksestä, mikä kertoisi bakteeripopulaation monimuotoisuuden vähentymisestä koejakson aikana. Aikapistenäytteet otettiin noin kuukauden välein. Koska mcrA-tietokantaa ei ollut käytettävissä, ei metanogeenisiä bakteereja pystytty karakterisoimaan ja näin ollen lopullista varmistusta menetelmän toimivuudesta ei saatu. Tutkimusta tullaan jatkamaan luomalla mcrA-tietokanta, jonka avulla voidaan karakterisoida metanogeeniset bakteerit biokaasureaktorissa.

This thesis concerned developing a method in order to quantify methanogenic bacteria from a pilot scale biogas plant treating sewage sludge by using the 454 pyrosequencing method. The thesis was part of the Susbio R&D project at Turku University of Applied Sciences. The goal was to determine the baseline of the methanogenic population in the pilot scale biogas plant within a certain time window by using the mcrA gene. In the theory section of this thesis, anaerobic digestion, methanogenic bacteria, the background of sequencing, and the gene sequence of a coenzyme working in methane formation are discussed. The practical part concerns the method development, sample preparation, and sequencing with the GS Junior device. The method appears to be functional based on the preliminary testing. The raw data was analyzed with Mothur. The first set of samples gave a result of 7000 unique sequences and in the second and third sets the amount of unique sequences dropped nearly to a half from the first set. This would indicate a decrease in biodiversity during the time window. The sample sets were taken on a monthly basis. Because of the absence of an mcrA database, methanogens could not be characterized. Thus the functionality of the method was not confirmed. The research will be continued by creating an mcrA database which can be used to characterize methanogenic bacteria in the biogas plant.