Western blot -menetelmän optimointi kantasoluista tuotetuille verkkokalvon soluille

Abstract

Ihmisalkion kantasolut voivat erilaistua silmän verkkokalvon pigmenttiepiteelin soluiksi. Kantasoluterapiasta toivotaan tulevaisuudessa uutta hoitomuotoa ikääntyvän silmän sairauksien hoidossa. Kantasolujen erilaistumista pigmenttiepiteelisoluiksi voidaan tarkastella sekä DNA- että proteiinitasolla. Western blot –menetelmän avulla solujen erilaistumista voidaan tutkia proteiinitasolla. Opinnäytetyön tarkoitus oli optimoida western blot –menetelmä silmän pigmenttiepiteelin tuottamille MITF-, RPE65- ja CRALBP-proteiineille. Tavoitteena oli optimoida sopiva kokonaisproteiinipitoisuus, löytää sopiva blokkausliuos ja etsiä toimivat primaari- ja sekundaarivasta-ainelaimennokset.

Ihmisalkion kantasoluja erilaistettiin aluksi 3-5 päivää ihmisen esinahan feeder-solujen päällä pigmenttiepiteeli-solujen kasvatusmediumissa. Tämän jälkeen solut irrotettiin mekaanisesti leikkaamalla maljalta ja siirrettiin kuoppalevylle. Solut eivät tartu kuoppalevyn pintaan, vaan kasvavat vapaana liuoksessa. Erilaistuneet solurykelmät kerättiin soluviljelmästä, ja proteiinit eristettiin soluista. Eristetyn proteiiniliuoksen pitoisuus mitattiin BCA-menetelmällä spektrofotometrisesti. Proteiinit eroteltiin toisistaan kokonsa mukaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Proteiinit siirrettiin geeliltä membraanille ja visualisoitiin vasta-aineiden avulla. Myös HeLa-syöpäsolulinjan soluja käytettiin vasta-aineiden testaamiseen, koska erilaistuneista RPE-soluista oli puutetta.

Käytetyistä vasta-aineista CRALBP saatiin toimimaan parhaiten RPE-soluilla. Tätä menetelmää voidaan käyttää jatkossa CRALBP-proteiinin tunnistamiseen soluista. RPE65-vasta-aine saatiin toimivaksi HeLa-soluilla, mutta ei RPE-soluilla. Ongelmana oli luultavasti RPE-solujen nuori ikä, jonka vuoksi tätä menetelmää tulee testata vielä kauemmin erilaistuksessa olleilla RPE-soluilla. MITF-vasta-ainetta ei saatu optimoitua, sillä ongelmaksi muodostui häiritsevä tausta. Tämän vasta-aineen optimointia tulee jatkaa tulevaisuudessa. MITF vasta-aineen optimoinnissa voidaan jatkossa testata erilaisia vasta-ainelaimennoksia sekä pyrkiä tehostamaan blokkaus-vaihetta.

Human embryonic stem cells can differentiate into retinal pigment epithelial (RPE) cells. Embryonic stem cells research holds significant potential for the treatment of disorders of ageing retina. Differentiation of retinal pigment epithelium from stem cells can be studied at both DNA and protein level. Cell differentiation can be examined at the level of protein with western blot method. The aim of this study was to optimize the western blot method for MITF, RPE65 and CRALBP proteins which are produced by eye pigment epithelium cells. The goal was to optimize the appropriate total protein content to find the right blocking buffer and determine good primary and secondary antibody dilutions.

Human embryonic stem cells were differentiated first 3-5 days over human foreskin feeder cells in the pigment cells culture medium. Next the cells were mechanically cut off from cell culture dish and transferred to the cell culture plate. Cells did not adhere on cell culture plate; instead they grew free in solution. The differentiated cells in cell culture were collected, and proteins were extracted from the cells. The protein concentration was measured spectrofotometrically using the BCA method. Proteins were separated from each other according to their size using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Proteins were transferred to membrane and visualized using antibodies. Also cells from cancer-derived HeLa cell line were used for testing antibodies, because of the lack of differentiated RPE cells.

According to the result, CRALBP antibody worked best with RPE cells. This method can further be used in detecting CRALBP protein in cells. RPE65 antibody was functional with HeLa cells, but not with RPE cells. The problem was probably caused by the unmatured stage of RPE cells. Therefore this method should be tested with even further differentiated RPE cells. Because of the high background staining, MITF antibodies could not be optimized. This antibody optimization should be continnued in the future. MITF antibody optimization could be continued by testing different antibody solutions and trying to make the blocking step more efficient.