Western blot -menetelmän optimointi kantasoluista tuotetuille verkkokalvon soluille
Huuki, Jaana (2010)
Huuki, Jaana
Tampereen ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201001201424
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201001201424
Tiivistelmä
Ihmisalkion kantasolut voivat erilaistua silmän verkkokalvon pigmenttiepiteelin soluiksi. Kantasoluterapiasta toivotaan tulevaisuudessa uutta hoitomuotoa ikääntyvän silmän sairauksien hoidossa. Kantasolujen erilaistumista pigmenttiepiteelisoluiksi voidaan tarkastella sekä DNA- että proteiinitasolla. Western blot –menetelmän avulla solujen erilaistumista voidaan tutkia proteiinitasolla. Opinnäytetyön tarkoitus oli optimoida western blot –menetelmä silmän pigmenttiepiteelin tuottamille MITF-, RPE65- ja CRALBP-proteiineille. Tavoitteena oli optimoida sopiva kokonaisproteiinipitoisuus, löytää sopiva blokkausliuos ja etsiä toimivat primaari- ja sekundaarivasta-ainelaimennokset.
Ihmisalkion kantasoluja erilaistettiin aluksi 3-5 päivää ihmisen esinahan feeder-solujen päällä pigmenttiepiteeli-solujen kasvatusmediumissa. Tämän jälkeen solut irrotettiin mekaanisesti leikkaamalla maljalta ja siirrettiin kuoppalevylle. Solut eivät tartu kuoppalevyn pintaan, vaan kasvavat vapaana liuoksessa. Erilaistuneet solurykelmät kerättiin soluviljelmästä, ja proteiinit eristettiin soluista. Eristetyn proteiiniliuoksen pitoisuus mitattiin BCA-menetelmällä spektrofotometrisesti. Proteiinit eroteltiin toisistaan kokonsa mukaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Proteiinit siirrettiin geeliltä membraanille ja visualisoitiin vasta-aineiden avulla. Myös HeLa-syöpäsolulinjan soluja käytettiin vasta-aineiden testaamiseen, koska erilaistuneista RPE-soluista oli puutetta.
Käytetyistä vasta-aineista CRALBP saatiin toimimaan parhaiten RPE-soluilla. Tätä menetelmää voidaan käyttää jatkossa CRALBP-proteiinin tunnistamiseen soluista. RPE65-vasta-aine saatiin toimivaksi HeLa-soluilla, mutta ei RPE-soluilla. Ongelmana oli luultavasti RPE-solujen nuori ikä, jonka vuoksi tätä menetelmää tulee testata vielä kauemmin erilaistuksessa olleilla RPE-soluilla. MITF-vasta-ainetta ei saatu optimoitua, sillä ongelmaksi muodostui häiritsevä tausta. Tämän vasta-aineen optimointia tulee jatkaa tulevaisuudessa. MITF vasta-aineen optimoinnissa voidaan jatkossa testata erilaisia vasta-ainelaimennoksia sekä pyrkiä tehostamaan blokkaus-vaihetta.
Ihmisalkion kantasoluja erilaistettiin aluksi 3-5 päivää ihmisen esinahan feeder-solujen päällä pigmenttiepiteeli-solujen kasvatusmediumissa. Tämän jälkeen solut irrotettiin mekaanisesti leikkaamalla maljalta ja siirrettiin kuoppalevylle. Solut eivät tartu kuoppalevyn pintaan, vaan kasvavat vapaana liuoksessa. Erilaistuneet solurykelmät kerättiin soluviljelmästä, ja proteiinit eristettiin soluista. Eristetyn proteiiniliuoksen pitoisuus mitattiin BCA-menetelmällä spektrofotometrisesti. Proteiinit eroteltiin toisistaan kokonsa mukaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Proteiinit siirrettiin geeliltä membraanille ja visualisoitiin vasta-aineiden avulla. Myös HeLa-syöpäsolulinjan soluja käytettiin vasta-aineiden testaamiseen, koska erilaistuneista RPE-soluista oli puutetta.
Käytetyistä vasta-aineista CRALBP saatiin toimimaan parhaiten RPE-soluilla. Tätä menetelmää voidaan käyttää jatkossa CRALBP-proteiinin tunnistamiseen soluista. RPE65-vasta-aine saatiin toimivaksi HeLa-soluilla, mutta ei RPE-soluilla. Ongelmana oli luultavasti RPE-solujen nuori ikä, jonka vuoksi tätä menetelmää tulee testata vielä kauemmin erilaistuksessa olleilla RPE-soluilla. MITF-vasta-ainetta ei saatu optimoitua, sillä ongelmaksi muodostui häiritsevä tausta. Tämän vasta-aineen optimointia tulee jatkaa tulevaisuudessa. MITF vasta-aineen optimoinnissa voidaan jatkossa testata erilaisia vasta-ainelaimennoksia sekä pyrkiä tehostamaan blokkaus-vaihetta.