Histidiinihännällisen mEGFP:n puhdistuksen optimointi

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää histidiinihännällisen monomeerisen vihreän fluoresoivan proteiinin (mEGFP) puhdistusprosessia. Tavoitteena oli optimoida proteiinin lämpökäsittelyn kesto ja lämpötila, puhdistettavan lysaatin koostumus sekä affiniteettikromatografiassa käytettävät puhdistusparametrit. Opinnäytetyö toteutettiin Turun ammattikorkeakoululle, jossa mEGFP:tä käytetään opetus- ja tutkimustarkoituksiin.

Esipuhdistusmenetelmänä toimivan lämpökäsittelyn optimoinnissa tarkasteltaviksi lämpötilapisteiksi valittiin 65, 70, 75 ja 80 °C ja aikapisteiksi 10, 20 ja 30 minuuttia. Näytteen koostumuksen parantamiseksi lisättiin näytteeseen nukleiinihappoja pilkkovaa bentsonaasientsyymiä. Affiniteettikromatografiassa tutkittiin eluutiopuskurin imidatsolipitoisuuden vaikutusta kohdeproteiinin irtoamiseen.

Lämpösaostuksen ja affiniteettikromatografian tuloksia tarkasteltiin fluoresenssi- ja proteiinin kokonaismäärämittauksella sekä SDS-PAGE:lla. Tulosten perusteella suotuisimmat lämpötila ja aika olivat 70 °C ja 10 minuuttia. Bentsonaasin lisäys helpotti supernatantin talteenottoa ja suodatusta. Affiniteettikromatografiassa kapein ja korkein eluutiopiikki saatiin nostamalla imidatsolin pitoisuus 50 mM:n, jolloin heikoiten kiinnittyneet proteiinit irtosivat, ja uudelleen 250 mM:n, jolloin mEGFP irtosi.

Opinnäytetyössä kerättyjä tietoja voidaan hyödyntää Turun ammattikorkeakoululla suoritettavissa laboratorio- ja hanketöissä. Yhteisesti sovittu prosessi helpottaa ja nopeuttaa työskentelyä sekä lisää vertailtavuutta.