Proteiinien puhdistus kaksifaasiuutolla hydrofobiini-proteiinin avulla

Abstract

Kaksifaasiuuttomenetelmät ovat vaihtoehto teollisuusmittakaavan proteiinien puhdistuksessa. Ne ovat edullisempia ja helpompia kuin monet perinteisesti käytetyt menetelmät. Vesi-detergenttikaksifaasiuuttoa on aikaisemmin käytetty hydrofobisten proteiinien puhdistuksessa, mutta viime aikoina on tutkittu mahdollisuutta käyttää menetelmää myös muiden proteiinien puhdistuksessa. Liittämällä kohdeproteiineihin pieni ja hydrofobinen hydrofobiini-niminen proteiini saadaan syntynyt fuusioproteiini puhdistettua käyttämällä vesi-detergenttikaksifaasiuuttoa. Opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia kahden eri hydrofobiinin sisältävän fuusioproteiinin puhdistusta vesi-detergenttikaksifaasiuutolla. Tutkittavat fuusioproteiinit olivat lakkaasi-HFBI ja GOX-HFBI (glukoosioksidaasi-HFBI). Proteiineille suoritettiin uuttokokeita ja GOX-HFBI:n puhdistuksessa testattiin myös pH:n vaikutusta puhdistustulokseen. Opinnäytetyössä perehdyttiin myös lakkaasi-HFBI:n entsyymiaktiivisuusmääritystapoihin ja tutkittiin mahdollisuutta käyttää lämpökäsittelyä esipuhdistusmenetelmänä lakkaasi-HFBI:n puhdistuksessa. Tehtyjen testien perustella GOX-HFBI siirtyi vesi-detergenttikaksifaasiuutossa osittain detergenttirikkaaseen faasiin. Mediumnäytteellä saanto oli 26 % ja lysaattinäytteellä 39 %. Menetelmä vaatii kuitenkin vielä optimointia ennen kuin sitä voidaan käyttää puhdistuksessa isommassa mittakaavassa. Lakkaasi-HFBI:n ei havaittu siirtyvän detergenttirikkaaseen faasiin. Tämä voi selittyä mahdollisella fuusioproteiinin hajoamisella ennen uuttovaihetta.

Aqueous two-phase systems are one option in large scale protein purification. Aqueous two-phase systems are usually cheaper and easier than many conventional protein purification methods. Surfactant-based aqueous two-phase systems previously have been used for the purification of hydrophobic proteins. Recently, the suitability of these methods for the purification of other proteins has been studied. A small and hydrophobic “hydrophobin” protein is added to the target protein. The fusion protein can then be purified by surfactant-based aqueous two-phase extraction. The purpose of this study was to purify two different hydrophobin containing fusion proteins by surfactant-based aqueous two-phase extraction. The studied proteins were laccase-HFBI and GOX-HFBI (glucose oxidase-HFBI). Extraction tests were carried out with both proteins. The influence of pH on the extraction system was studied with GOX-HFBI. In this study, the enzyme activity assay procedures of laccase-HFBI were investigated. The possibility of using heat treatment as a preliminary purification step for laccase-HFBI was also studied. The tests show that GOX-HFBI was partially extracted in the surfactant-rich phase. The yield was 26 % when the medium sample was extracted and 39 % when the lysate sample was extracted. This method requires further optimization before it can be used in large scale purification. Laccase-HFBI was not extracted in the surfactant-rich phase. This may be due to the degradation of the fusion protein before the extraction step.