Ihmissolupohjaisen sydänmallin alustapinnoitukset eri materiaaleilla

Abstract

Eläinkokeettomien testausmenetelmien kehitystä ja käyttöönottoa on pyritty viime vuosina lisäämään kansainvälisesti. EU edellyttää jäsenmaidensa käyttävän vaihtoehtoisia testausmenetelmiä aina kun se on mahdollista. Voimaantulleista lakimuutoksista huolimatta eläinkokeiden määrä on kasvussa, sillä validoituja testausmenetelmiä on olemassa toistaiseksi vain muutamia. Ihmissolupohjaiset testimenetelmät voivat tarjota tulevaisuudessa eläinkokeita eettisemmän, nopeamman ja luotettavan vaihtoehdon tutkittaessa yhdisteiden vaikutusta ihmiseen. Sydänmalli koostuu verisuonirakenteita muodostavista soluista sekä sydänlihassoluista. Ihmissolupohjaisen sydänmallin kehitysprojektin pyrkimyksenä on eläinkokein suoritettavien toksisuustestien korvaaminen in vitro -testillä.

Sydänsolumallin kehittämisessä haasteena on ollut solujen irtoaminen sydänmittauksia varten kehitetyiltä kasvatusalustoilta ennen tarpeeksi pitkän viljelyajan saavuttamista. Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia erilaisia pinnoitusmateriaaleja ja löytää niistä solujen kiinnittymistä ja rakenteiden muodostumista edistävä vaihtoehto, joka soveltuisi parhaiten sydänmallin kehitysprojektin tarkoituksiin. Lisäksi tavoitteena oli tutkia, olisiko happiplasmakäsittelyllä solumallin kiinnipysymistä edistävä vaikutus.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli testata kaupallisia fibronektiini-, laminiini- ja kollageeni IV -pinnoitemateriaaleja, sekä itse valmistettuja gelatiini-, polyetyleeni-imini- ja nitroselluloosapinnoitteita eri viljelyalustaformaateilla. Sydänmallin toiminnallisia mittauksia varten kehitetyille kasvatusalustoille tehtiin happiplasmakäsittely. Tuloksia arvioitiin sydänlihassolujen morfologiassa ja verisuonirakenteissa tapahtuvia muutoksia seuraamalla immunovärjäyksin, sekä sydänlihassolujen sykinnän tiheyttä ja synkronisuutta määrittävin mittauksin.

Tutkimuksessa käytetyistä pinnoitusmateriaaleista nitroselluloosa- ja polyetyleeni-iminipinnoitteet toimivat huonosti. Parhaiten toimi fibronektiini, mutta erot fibronektiinin ja muiden pinnoitusyhdisteiden välillä eivät olleet suuria. Happiplasmakäsittelyllä oli lievästi sydänmallin kiinnipysymistä parantava vaikutus, mutta vaikutus oli lyhytkestoinen. Tutkimuksessa havaittiin verisuonirakenteilla olevan selkeä vaikutus sydänlihassolujen morfologiaan.

The studies and the use of methods to replace animal testing have been internationally increasing in the past years. The EU requires its member countries to use alternative testing methods whenever it is possible. Regardless of the law, the number of tests performed on animals is on the rise, as validated testing methods exist so far only a few. Human-cell-based testing methods may offer a more ethical, reliable and faster alternative for the animal experiments in the future. In vitro cardiovascular construct is based on co-culture of vascular-like structures and human cardiomyocytes. The aim of the research on the human-cell-based cardiovascular model is to replace toxicity tests performed on animals with in vitro tests. One of the challenges in cardiovascular construct has been achieving sufficiently long culturing periods before the cells start to detach.

The objective of this Bachelor’s thesis was to study different methods to increase the adherence of the cells of cardiovascular construct. Effects of the treatments on vascular-like structures and morphology of cardiomyocytes were also studied. The purpose of the study was to test several coating materials such as fibronectin, laminin, collagen (type IV), gelatin, polyethylene imine and nitrocellulose. An effect of an oxygen plasma treatment was also tested. The results of morphology, immunostaining and micro electrode array recordings were used when testing products.

Fibronectin was the most promising coating material, but the differences between fibronectin, laminin and type IV collagen were only slightly significant. Polyethylene imine and nitrocellulose proved not to be applicable coating material for the cardiovascular construct. The oxygen plasma treatment had a slightly improving effect on the cell construct attachment. The findings indicated that the vascular-like structures affect the morphology of cardiomyocytes.