Kuusen monolignoliproteiinikandidaatin lokalisaatio tupakan BY-2-soluissa

Abstract

Oxygen stress tolerance and lignin biosynthesis research group toimii Bio- ja ympäristötieteellisessä tiedekunnassa. Tiedekunta on yksi Helsingin yliopiston yhdestätoista tiedekunnasta. Työryhmä tutkii kuusen ligniiniä ja kasvin solujen puutumista. Projektin tarkoituksena on tutkia erilaisten mahdollisten kuusen ligniinikuljettajaproteiinien käyttäytymistä tupakan BY-2-solussa.

Opinnäytetyön tavoitteena oli tuottaa ja tutkia kuusen monolignolikuljettajaproteiinikandidaattia PAAP7. Kuljettajaproteiinin lokalisaatiota tutkittiin tupakan BY-2-soluissa konfokaalimikroskopialla. PAAP7-geeni yhdistettiin pDONR221-vektoriin Gateway kloonaukseen sisältyvän BP-reaktion avulla. Ekspressiovektoriin lisättiin geeni, joka ekspressoitui GFP-fluoresenssimerkkinä. Ekspressiovektori transformoitiin agrobakteerin avulla tupakan BY-2-soluihin. Tulokset tarkistettiin konfokaalimikroskoopilla.

Työssä onnistuttiin tuottamaan eläviä tupakan BY-2:ia, jotka tuottavat kuusen monolignolikuljetusproteiinia, jossa on fluoresoiva GFP-proteiini. Konfokaalikuvat olivat haastavia. Huomattiin, että stressaantuneet ja kuolleet BY-2-solut fluoresoivat samalla aaltopituudella kuin fluoresenssiproteiini GFP.

Jatkotutkimusideoina GFP-fuoresenssi-leiman tilalle voisi kokeilla toista leimaa. Agrobakteerilla voisi tehdä suoran agroinfiltraation tupakkakasvin lehdelle. Tuotetulle tupakan BY-2-PAAP7- solulinjalle tulisi tehdä lisää konfokaalimikroskopointia ja tarkastella uusitun solukon käyttäytymistä.

The Oxygen Stress Tolerance and Lignin Biosynthesis Research Group operates in the Faculty of Bio and Environmental Sciences. The faculty is one of the eleven faculties of the University of Helsinki. The working group studies spruce lignin and plant cell lignification. The purpose of the project is to investigate the behavior of various possible spruce lignin transporter proteins in tobacco BY-2 cells.

The aim of the thesis was to produce and study the spruce monolignol transporter protein candidate PAAP7. The localization of the transporter protein was investigated in tobacco BY-2 cells by confocal microscopy. The PAAP7 gene was combined with the pDONR221 vector using the BP-reaction included in Gateway technology. A gene which is expressed as a GFP fluorescence marker, was added to the expression vector. The expression vector was transformed into tobacco BY-2 cells via Agrobacterium. The results were checked with a confocal microscope.

The work succeeded in producing live tobacco BY-2, which produced spruce monolignol transport protein with a fluorescein GFP protein. Confocal images were challenging. It was noticed that stressed and dead BY-2 cells fluoresce at the same wavelength as the fluorescence protein GFP.

As ideas for further research, instead of the GFP fluorescence label, another label could be used. Agrobacterium could be used for direct agroinfiltration on the leaf of a tobacco plant. More confocal microscopy should be performed on the produced tobacco BY-2-PAAP7 cell line and the behavior of the regenerated cells should be examined.