Real-time PCR -menetelmän soveltaminen Yersinia enterocolitican osoittamiseksi kasvisnäytteistä

Abstract

Kasvisperäisten ruokamyrkytysten määrä on lisääntynyt viime vuosina, mikä on johtanut perinteisiä viljelymenetelmiä nopeampien ja herkempien osoittamismenetelmien kehittämistarpeeseen. DNA-tekniikoihin perustuvat menetelmät ovat spesifisiä ja herkkiä, ja erityisesti PCR -menetelmien käyttö on yleistynyt todettaessa patogeeneja elintarvikenäytteistä.

Tämä opinnäytetyö tehtiin Hämeenlinnan seudun kansanterveystyön kuntayhtymän Ympäristö- ja elintarvikelaboratoriossa TavastLab:ssa. Työssä sovellettiin kasvisnäytteille real-time PCR –menetelmää (kehitetty Ruotsissa, Statens Livsmedels Verket SLV) Yersinia enterocolitican osoittamiseksi. Menetelmän kehittäminen on edellytys sille, että menetelmä voidaan validoida ja hakea sille akkreditointia. Kokeita tehtiin PCR -komponenttien toimivuuden ja reaktion tehokkuuden testaamiseksi. Menetelmän lineaarisuus ja toteamisraja määritettiin puhdasviljelmän laimennussarjasta sekä ympätyillä salaattinäytteillä. Vertailtavana oli neljä DNA:n eristysmenetelmää (PrepMan Ultra, Applied Biosystems; PrepMan Ultra + DNA-saostus, Applied Biosystems; JetQuick, Genomed; MasterPure DNA Purification Kit, Epicentre Biotechnologies). Parhaaksi valitun eristysmenetelmän toimivuutta testattiin myös muilla elintarvikematriiseilla.

Menetelmän reaktiotehokkuus todettiin optimaaliseksi (99,9 %), menetelmä todettiin lineaariseksi ja rikastusvaiheen jälkeen toteamisrajaksi kasvisnäytteistä saatiin alle 10 pmy/25 g:n näyte. Eristysmenetelmistä parhaaksi todettiin PrepMan Ultra DNA-saostuksella, jolla rinnakkaismääritysten hajonta oli pienin, Ct-arvot matalimmat ja delta-Rn –arvot suurimmat. Kehittämistyön jälkeen menetelmä on validoitu ja sille on haettu akkreditointia. Menetelmä on otettu Tavastlab:ssa rutiinikäyttöön.

During the last years the number of food poisonings orginated from vegetables have increased. Traditional culture methods are time-consuming and not sensitive enough. These facts had caused a need to develop more rapid methods for the detection of food-borne pathogens. The use of sensitive and specific DNA-based methods, especially PCR-methods, have become more common. The project was commissioned by Environmental and Food Research Laboratory TavastLab. The aim was to set up a real-time PCR method (developed at Statens Livsmedels Verket SLV, Research and Development Department, National Food Administration, Uppsala, Sweden) in the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in vegetables. Setting up the method is a prerequisite for validation and accreditation. The first experiments were done to show the workability of PCR-components and to specify the reaction efficiency. More experiments were done to prove the linearity and detection limit with dilutions of pure cultures and inoculated salad samples. There were four DNA-extraction kits to compare (PrepMan Ultra, Applied Biosystems; PrepMan Ultra + DNA-precipitation, Applied Biosystems; JetQuick, Genomed; MasterPure DNA Purification Kit, Epicentre Biotechnologies). Some tests were also done on other food samples. The reaction efficiency of the method was found out to be optimal (99.9%). The method was linear and the detection limit in the lettuce was under 10 pmy/25 g. PrepMan Ultra with DNA-precipitation was found to be the best extraction method, because the standard deviation with simultaneous test was minimum, Ct-values were the lowest and delta-Rn-values were the highest. After the development done in this work the method has been validated and the accreditation has been applied to. In Tavastlab the method has now been introduced in routine work.