Kapillaarivirtausmenetelmän optimointi hiiren endoteelisoluilla

Abstract

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia leukosyyttien tarttumista hiiren endoteelisoluihin. Tarkoituksena oli löytää olosuhteet, joissa leukosyyttejä tarttuisi, pyörisi ja transmigroituisi endoteeliin in vitro –olosuhteissa. Opinnäytetyön toimeksiantajana oli leukosyyttien liikennettä tutkiva tutkimusryhmä Turun Yliopiston lääketieteellisessä tiedekunnassa. Menetelmää tullaan hyödyntämään myöhemmin käyttämällä poistogeenisiä hiirikantoja ja tutkimalla niistä eristettyjen endoteelisolujen kykyä sitoa valkosoluja. Työssä hyödynnettiin tutkimuslaboratorion henkilökunnan asiantuntemusta. Puolet opinnäytetyöstä koostui verisuonten endoteelisolujen eristyskeinon löytämisestä ja optimoinnista. Hiiren kudoksista eristettäviin soluihin käytettiin kahta magnetismia hyödyntävää eristysmenetelmää. Toinen puoli työstä oli löytää olosuhteet leukosyyttien tarttumiselle kapillaarivirtausmenetelmällä. Kapillaarivirtausmenetelmässä virtauskammioon istutettiin endoteelisoluja, joille aiheutettiin tulehdusreaktio stimuloimalla soluja kasvainkuoliotekijä-:lla. Kammion läpi laitettiin virtaamaan leukosyyttejä, joiden tarttumista endoteelinpintaan virtausolosuhteissa tutkittiin mikroskoopin avulla. Kokeissa käytettiin kahta kaupallista solulinjaa ja eristettyjä primaarisoluja. Opinnäytetyössä saatiin optimoitua olosuhteet, joilla endoteelisoluja onnistuttiin eristämään kapillaarivirtausmenetelmän tarkoituksiin. Solumäärät olivat kohtuullisen vähäiset, joten menetelmä ei ole vielä riittävän tehokas. Kapillaarivirtausmenetelmä saatiin kuitenkin toimimaan hiiren endoteelisoluilla ja leukosyyttejä saatiin tarttumaan endoteeliin. Tarttuneiden solujen määrä kasvoi kokeen alussa lisäämällä leukosyyttien määrää. Kasvainkuoliotekijä-:n stimulaatioajan kasvattaminen vaikutti tarttuneiden solujen määrään lisääntymiseen. Kapillaarivirtausmenetelmä saatiin pystytettyä hiiren endoteelisoluille käytettäväksi ja primaarisia endoteelisoluja saatiin eristettyä kapillaarivirtausmenetelmän kokeisiin.

The objective of this Bachelor’s Thesis was to investigate leukocyte adhesion to mouse endothelial cells. The aim was to find conditions where leukocytes would adhere, roll and transmigrate onto, along and through the endothelium in in vitro conditions. The study was commissioned by a research group studying leukocyte trafficking at Turku University Faculty of Medicine. This protocol will later be utilized on specific knockout mice population endothelial cells to investigate their ability to adhere leukocytes. The expertise of the laboratory personnel was utilized during this Bachelor’s Thesis project. The first half of this project consisted of finding and optimizing an isolation method for vascular endothelial cells. Two magnetic isolation methods were used to isolate the cells from mouse tissue. The second half of this thesis was to find conditions where leukocytes would adhere using a flow assay research method. Endothelial cells were seeded into a flow chamber and induced with an inflammation-causing stimulant in the flow assay method. A cytokine, mouse tumor necrosis factor- was used as a stimulant. Leukocytes were subjected to flow through the chamber and their adhesion to the endothelium was observed with a microscope. Two commercial cell lines and isolated primary cells were used in these experiments. The conditions where endothelial cells were successfully isolated for the flow assay purpose were optimized in this project. However, the number of cells was relatively low, and thus, the protocol is not as efficient as it could be. A flow assay was successfully established for mouse endothelial cells and leukocyte adhesion to the endothelium was achieved. The number of adhered cells increased as the amount of leukocytes was increased in the flow chamber experiments. Also the stimulation time applied to the endothelium had a positive impact on the number of adhering cells.