Histidiinihännällisen mEGFP-yhdistelmäproteiinin tuottaminen mikrobisoluilla : yhdistelmä-DNA:n valmistaminen ja testaaminen sekä yhdistelmäproteiinin varmentaminen
Davidsson, Meri (2022)
Davidsson, Meri
2022
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2022121730695
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2022121730695
Tiivistelmä
Turun ammattikorkeakoulun tutkimusryhmä ”Uudet materiaali ja prosessit” tarvitsee fluoresoivaa mEGFP-yhdistelmäproteiinia mallimolekyyliksi tutkimuksiaan varten. Kaupallisesti hankittuna se on kallista, minkä vuoksi sitä olisi suuri hyöty pystyä valmistamaan itse. Yhdistelmäproteiiniin halutaan mukaan histidiinihäntä, jotta se voidaan puhdistaa affiniteettikromatografialla.
Tässä opinnäytetyössä pääpainona oli valmistaa halutunlaista yhdistelmäproteiinia koodaavaa yhdistelmä-DNA:ta. Lopuksi vielä testattiin yhdistelmä-DNA:n toimivuutta ilmentämällä sen koodaamaa yhdistelmäproteiinia, minkä jälkeen se puhdistettiin ja varmennettiin oikeankokoiseksi.
Yhdistelmä-DNA valmistettiin alakloonauksella eli restriktiodigestiota hyödyntävällä kloonausmenetelmällä. Inserttinä käytettiin mEGFP-geeniä, jota monistettiin PCR:llä. Vektorina käytettiin pET-32b (+):tä, jossa on yhdistelmä-DNA:han mukaan haluttu histidiinihäntää koodaava geeni. Isäntäsoluina käytettiin NEB T7 Express -soluja.
Aluksi insertti ja vektori tehtiin yhteensopiviksi restriktiodigestiolla, jonka jälkeen ne saatiin liitettyä toisiinsa ligaatiolla. Tällöin muodostui yhdistelmä-DNA, joka siirrettiin isäntäsoluihin transformaatiossa elektroporaatiolla. Transformanttien selektio tehtiin ampisilliiniresistenssin avulla. Lopuksi varmennettiin, että transformanteissa oli oikeanlainen yhdistelmä-DNA diagnostisella restriktiodigestiolla.
Yhdistelmäproteiineja ilmennettiin isäntäsolujen avulla. Puhdistuksessa hyödynnettiin histidiinihäntää, jonka ansiosta voitiin käyttää kiinteän faasin metalli-ioniaffiniteettikromatografia -tekniikkaa (IMAC). Puhdistuksen jälkeen, kerätyt näytteet analysoitiin BCA:lla, fluoresenssimittauksella ja SDS-pagella. Lopuksi tehtiin vielä Western blot, jolla saatiin varmennettua yhdistelmäproteiini oikeanlaiseksi.
Lopulta saatiin varmistettua, että halutunlaista histidiinihännällistä mEGFP-yhdistelmäproteiinia koodaavaa yhdistelmä-DNA:ta onnistuttiin valmistamaan. Sillä voidaan siis jatkossa valmistaa lisää yhdistelmäproteiinia, jota voidaan sitten hyödyntää tutkimusryhmän tutkimuksissa mallimolekyylinä.
Tässä opinnäytetyössä pääpainona oli valmistaa halutunlaista yhdistelmäproteiinia koodaavaa yhdistelmä-DNA:ta. Lopuksi vielä testattiin yhdistelmä-DNA:n toimivuutta ilmentämällä sen koodaamaa yhdistelmäproteiinia, minkä jälkeen se puhdistettiin ja varmennettiin oikeankokoiseksi.
Yhdistelmä-DNA valmistettiin alakloonauksella eli restriktiodigestiota hyödyntävällä kloonausmenetelmällä. Inserttinä käytettiin mEGFP-geeniä, jota monistettiin PCR:llä. Vektorina käytettiin pET-32b (+):tä, jossa on yhdistelmä-DNA:han mukaan haluttu histidiinihäntää koodaava geeni. Isäntäsoluina käytettiin NEB T7 Express -soluja.
Aluksi insertti ja vektori tehtiin yhteensopiviksi restriktiodigestiolla, jonka jälkeen ne saatiin liitettyä toisiinsa ligaatiolla. Tällöin muodostui yhdistelmä-DNA, joka siirrettiin isäntäsoluihin transformaatiossa elektroporaatiolla. Transformanttien selektio tehtiin ampisilliiniresistenssin avulla. Lopuksi varmennettiin, että transformanteissa oli oikeanlainen yhdistelmä-DNA diagnostisella restriktiodigestiolla.
Yhdistelmäproteiineja ilmennettiin isäntäsolujen avulla. Puhdistuksessa hyödynnettiin histidiinihäntää, jonka ansiosta voitiin käyttää kiinteän faasin metalli-ioniaffiniteettikromatografia -tekniikkaa (IMAC). Puhdistuksen jälkeen, kerätyt näytteet analysoitiin BCA:lla, fluoresenssimittauksella ja SDS-pagella. Lopuksi tehtiin vielä Western blot, jolla saatiin varmennettua yhdistelmäproteiini oikeanlaiseksi.
Lopulta saatiin varmistettua, että halutunlaista histidiinihännällistä mEGFP-yhdistelmäproteiinia koodaavaa yhdistelmä-DNA:ta onnistuttiin valmistamaan. Sillä voidaan siis jatkossa valmistaa lisää yhdistelmäproteiinia, jota voidaan sitten hyödyntää tutkimusryhmän tutkimuksissa mallimolekyylinä.