Bakteeri-DNA:n eristys lehmän maidosta : menetelmän optimointi

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin osana kansainvälistä HoloRuminant-projektia. Projektissa tutkitaan märehtijöihin liittyviä mikrobiomeja ja niiden vaikutusta eläinten hyvinvointiin elinkaaren eri vaiheissa. Projektissa on 25 toimijaa 17:sta eri maasta. Yhteistyötoimijat ovat tutkimusorganisaatioita, voittoa tavoittelemattomia yhdistyksiä ja viljelijä- sekä rotujärjestöjä. Suomesta projektissa on mukana Luonnonvarakeskus. Optimoitua eristysmenetelmää tullaan käyttämään bakteeri-DNA:n eristykseen maitonäytteistä, jotka on kerätty poikineilta lehmiltä, tasaisin väliajon. Eristetyn DNA:n avulla maidon bakteerit pyritään tunnistamaan ja niiden mahdollista muutosta maidossa seurataan testiajanjakson aikana.

Opinnäytetyö tehtiin yhdessä Luonnonvarakeskuksen kanssa, Jokioisten toimipisteessä, Genomiikka ja jalostus -ryhmässä. Työn tavoitteena on optimoida bakteeri-DNA:n eristysmenetelmä lehmän maitonäytteille. Työn tarkoituksena on havainnoida ja kokeellisesti osoittaa eristysmenetelmässä olevat työvaiheet, joiden tehostaminen tai muuttaminen voisi parantaa eristetyn DNA:n saantoa ja menetelmän toistettavuutta. Maitonäytteissä esiintyvien kaseiinien esikäsittelymenetelmien testaus oli oleellisin osa menetelmän optimointia. Lisäksi menetelmässä testattiin sentrifugoinnin ja homogenoinnin sekä automaation vaikutusta eristetyn DNA:n saantoon. Menetelmän toimivuutta varmistettiin maitohappobakteerin avulla ja eristettyjä maitonäytteitä verrattiin utaretulehdusdiagnoosin saaneen lehmän maitoon.

Tehtyjen koe eristysten perusteella päädyttiin käyttämään EDTA:ta kaseiinien saostumisen estämiseksi. Eristystä häiritsevien kaseiinien onnistunut poistaminen mahdollisti suurempien DNA-pitoisuuksien mittaamisen maitonäytteistä. Näytteet soveltuivat myös automaattieristykseen Qiagenin Qiacube Connect -laitteella ja niistä onnistuttiin eristämään maitohappobakteerin DNA:ta onnistuneesti. Sentrifugin käyttö optimoitiin Luonnonvarakeskuksen tutkijoille valmiiksi menetelmää varten, mutta tehtyjen testien perusteella menetelmän muita työvaiheita ei muutettu optimoinnin tuloksena. Tulosten ja toistettavuuden varmistamiseksi tehdyt koe-eristykset tulisi toistaa useammin.

This thesis was done as a part of the HoloRuminant project funded by European Union's Horizon 2020 research and innovation program (Grant Agreement No 101000213). Project examines ruminant-related microbiomes and their effect on the animal's well-being at different stages of the life cycle. The project has 25 actors from 17 different countries. Collaborators are research organizations, non-profit associations and farmer and breed organizations. From Finland, the Natural Resources Institute Finland is participating the project. The optimized isolation method will be used to isolate bacterial DNA from milk samples collected from calving cows at regular intervals. With the help of the isolated DNA, the aim is to identify the bacteria composition (i.e. microbiome) in the milk, and to monitor changes in microbiome during mastitis and/or different lactation phases.

The thesis was done in the Natural Resources Institute Finland, at Jokioinen, in the Genomics and breeding group. The aim of the work was to optimize the bacterial DNA isolation method for cow's milk samples. The purpose of the work was to observe and experimentally demonstrate the working steps in the isolation method, the enhancement or modification of which could improve the yield of the isolated DNA and the reproducibility of the method. The testing of pretreatment methods for caseins present in milk samples was the most important part of the optimization of the method. In addition, the method tested the effect of centrifugation and homogenization as well as automation on the yield of isolated DNA. The functionality of the method was verified with the help of lactic acid bacteria and the isolated milk samples were compared to the milk of a cow diagnosed with mastitis.

Based on the test isolations, it was decided to use EDTA to prevent precipitation of caseins. The successful removal of caseins interfering with the isolation made it possible to measure higher DNA concentrations in the milk samples. The samples were also suitable for automatic isolation with Qiagen's Qiacube Connect device, and the DNA of lactic acid bacteria was successfully isolated from them. The use of the centrifuge was optimized for the Natural Resources Institute`s researchers. Based on the tests performed, the other working steps of the method were not changed because of the optimization. To ensure results and reproducibility, the test isolations made should be repeated more often.